活细胞中脂质扩散的高速干涉散射追踪显微镜技术

《ChemPhysChem》：High-Speed Interferometric Scattering Tracking Microscopy of Compartmentalized Lipid Diffusion in Living Cells

本研究利用干涉散射显微术（ISCAT）在生理条件下追踪活细胞膜磷脂类似物的扩散动力学。通过高精度单分子轨迹分析和无偏统计学方法，发现无论是20nm还是40nm的金纳米颗粒标记，脂质扩散模式均为瞬态隔室化扩散，平均隔室尺寸100-110nm，约束时间8-10ms。单轨迹分析显示扩散异质性，包括自由扩散（7-8%）、完全约束（13-14%）、瞬态隔室化（40%）和异常扩散（40%）。蒙特卡洛模拟验证了实验结果，并显示大颗粒标记的脂质具有更低的扩散系数和更强的约束强度。不同技术（FCS、STED-FCS）的约束强度一致，支持膜脂动态隔室化模型的普适性。

　　在细胞生物学和生物物理学领域，细胞膜的动态行为一直是研究的热点。特别是对于膜脂质的横向扩散机制，科学家们提出了多种可能的模型，其中“跳跃式”扩散（transient compartmentalized diffusion）被认为是由膜上存在的局部结构（如膜蛋白形成的“栅栏”结构）所导致的一种复杂扩散模式。这种模式意味着脂质在局部区域内快速扩散，然后在较长的时间尺度上缓慢地从一个区域移动到另一个区域。然而，这种扩散行为的观察和解释一直存在争议，因为不同实验方法和探针类型可能会对结果产生不同的影响。

本文通过使用一种高精度的干涉散射显微镜（interferometric scattering microscopy, ISCAT）技术，结合一种无偏的统计驱动分析流程，重新评估了细胞膜中脂质的扩散动态。ISCAT显微镜是一种近年来发展起来的技术，它能够以高采样率（如2?kHz）捕捉到细胞膜中脂质的长时间连续轨迹，从而为研究脂质的动态行为提供了新的视角。与传统的荧光显微镜不同，ISCAT通过干涉图来增强信号-噪声比（signal-to-noise ratio, SNR），从而实现了更高的定位精度。这一技术的引入使得研究人员可以使用更小的探针，如直径为20?nm的金纳米颗粒（Au NPs），以减少对细胞膜的干扰，同时仍能获得高质量的轨迹数据。

研究团队选择了两种不同大小的金纳米颗粒，即直径为20?nm和40?nm的Au NPs，分别标记了生物素化的磷脂类模拟物（DSPE-PEG2000-Biotin），并在Ptk2细胞的细胞膜上进行了高通量的单粒子轨迹追踪。通过统计分析和模型拟合，研究发现，在整体平均层面，这两种探针标记的脂质的扩散模式都倾向于“跳跃式”扩散，其平均膜区域大小约为100–110?nm，短暂的限制时间约为8–10?ms，膜内扩散系数为0.7–0.9?μm2/s，膜间扩散系数为0.3–0.4?μm2/s。而在单轨迹层面，研究人员观察到更复杂的扩散模式，包括约7–8%的自由扩散、13–14%的受限扩散、40%的短暂膜区扩散以及40%的异常扩散。这表明，脂质在细胞膜中的扩散行为具有高度的异质性。

值得注意的是，不同尺寸的金纳米颗粒对扩散速率和限制强度产生了显著影响，但并未改变脂质的扩散模式本身。这意味着，脂质在细胞膜中的扩散机制可能具有一定的普遍性，而探针的物理特性（如大小）主要影响的是实验数据的采集精度和对扩散行为的表征。为了进一步验证这一发现，研究团队利用蒙特卡洛模拟对数据进行了分析，并与之前的相关研究进行了对比。这些模拟结果支持了脂质在细胞膜中确实经历了短暂的膜区扩散，同时也揭示了这种扩散行为的统计特征。

此外，研究还提出了一个用于量化分析的无偏统计方法，这种方法可以用于从单轨迹数据中提取关于扩散模式的信息。传统的单分子追踪（single particle tracking, SPT）方法通常受到定位精度的限制，尤其是在高时间分辨率下，实验噪声可能会影响对扩散行为的判断。而ISCAT技术由于其高信号-噪声比，使得研究人员能够直接从数据中提取动态定位精度（dynamic localization precision），并结合这一精度对扩散系数进行修正。这种分析方法不仅能够更准确地识别脂质的扩散模式，还能揭示膜结构对脂质扩散行为的影响。

在对数据的进一步分析中，研究人员发现，脂质的扩散行为与细胞膜的拓扑结构密切相关。特别是，膜上的结构可能包括如F-actin网格、膜蛋白形成的“栅栏”结构，以及潜在的其他物理屏障。这些结构在空间尺度上通常在100–200?nm范围内，而在时间尺度上则在毫秒级别。这些结果与之前的研究一致，表明细胞膜的脂质扩散行为确实存在复杂的时空特征。

同时，研究还强调了探针尺寸对实验结果的影响。使用较小的金纳米颗粒（如20?nm）能够提供更高的定位精度，而使用较大的金纳米颗粒（如40?nm）则可能在一定程度上影响脂质的扩散速率和限制强度。然而，无论使用哪种探针，脂质的扩散模式仍以“跳跃式”扩散为主，说明这种扩散机制可能是细胞膜中普遍存在的现象。研究团队还通过与之前采用STED-FCS和SPT技术的研究进行对比，进一步确认了这些结果的可靠性。

在对单轨迹数据的分析中，研究团队发现，脂质的扩散行为存在显著的异质性。部分脂质表现出自由扩散，部分表现出受限扩散，而大部分则遵循“跳跃式”扩散模式。此外，异常扩散（anomalous diffusion）在数据中也占据了一定比例，这可能与膜结构的不均匀性、脂质与膜蛋白之间的相互作用，或是细胞膜的三维结构有关。这些发现表明，细胞膜的脂质扩散行为并非单一的模式，而是由多种因素共同作用的结果。

研究团队还开发了一种基于蒙特卡洛模拟的分析框架，以验证这些观察结果。通过模拟不同大小的膜区和不同的扩散系数，研究人员能够更准确地解释实验数据，并进一步探讨脂质在膜区之间的跳跃行为。这一框架不仅帮助研究人员更清晰地理解膜结构对脂质扩散的影响，也为未来在不同细胞类型和实验条件下研究脂质动态行为提供了新的工具。

综上所述，本研究通过ISCAT显微镜和无偏统计分析方法，揭示了细胞膜中脂质扩散行为的复杂性。无论使用哪种探针，脂质的扩散模式都表现出显著的异质性，而这种异质性可能与细胞膜的结构特性密切相关。研究结果不仅支持了“跳跃式”扩散模型，还为理解细胞膜的纳米组织提供了新的视角。此外，研究还强调了不同实验方法和探针类型对数据采集和分析的影响，表明在研究细胞膜动态行为时，需要综合考虑多种因素，以获得更准确和全面的结论。