四重TaqMan-MGB qPCR技术快速精准鉴别四种水禽细小病毒（cGPV、MDPV、MDGPV与SBDSV）及其流行病学意义研究

本研究开发了一种高效、特异的四重TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法，可同步检测并区分cGPV、MDPV、MDGPV和SBDSV四种水禽细小病毒。该方法灵敏度高（101–103 copies/μL），特异性强，重复性良好（CV < 2%），在337份临床样本中检出率（58%）显著优于常规PCR，为水禽细小病毒感染的快速诊断、混合感染鉴定及流行病学监测提供了可靠技术支撑。

引言

水禽细小病毒（Waterfowl Parvoviruses, WPVs）是一类感染鸭、鹅等重要经济水禽的单链DNA病毒，属于细小病毒科（Parvoviridae）、依赖病毒属（Dependoparvovirus）。主要包括经典鹅细小病毒（classical Goose Parvovirus, cGPV）、番鸭细小病毒（Muscovy Duck Parvovirus, MDPV）、番鸭源鹅细小病毒（Muscovy Duck-origin Goose Parvovirus, MDGPV）以及短喙矮小综合征病毒（Short Beak and Dwarfism Syndrome Virus, SBDSV，又称Novel Goose Parvovirus, NGPV）。这些病毒基因组结构紧凑，长约5.0–5.3 kb，两端为反向末端重复序列（ITR），编码非结构蛋白NS1、NS2和结构蛋白VP1–VP3。

由于它们之间遗传相似性高（例如SBDSV与cGVP核苷酸同源性达94%–97%），且临床中混合感染频发，传统方法难以实现快速、准确分型。全基因组测序虽然准确，但耗时长、成本高，不适用于临床大规模筛查。因此，建立一种可同时鉴别这四种病毒的多重分子检测方法，对于水禽病毒病防控具有重要意义。

材料与方法

本研究选用实验室保存的cGPV毒株NP5、MDPV毒株P、MDGPV毒株D和SBDSV毒株M15作为阳性参考毒株，并包括鸭腺病毒（DAdV-B2）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭瘟病毒（DEV）等作为阴性对照。临床样本共337份，采集自2021–2025年中国南方水禽养殖场，包括口咽拭子、泄殖腔拭子及组织样本（肝、脾、肾、肠）。

通过比对GenBank中收录的WPVs全基因组序列，选择VP基因保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针。每种病毒对应一条独特荧光标记探针：cGPV为Cy5，MDPV为VIC，MDGPV为Texas Red，SBDSV为FAM。所有探针3′端均修饰MGB基团，以提高结合特异性和熔解温度。

将各病毒目标片段克隆至pMD18-T载体，构建重组质粒标准品p-cGPV、p-MDPV、p-MDGPV和p-SBDSV，经测序验证后定量，并制备10⁹–10⁰ copies/μL的系列稀释标准品用于灵敏度评价。反应体系经矩阵法优化，最终确定20 μL体系包含10 μL 2×预混液、各引物终浓度0.2 μM、各探针终浓度0.1 μM。扩增程序包括：53°C 10 min（UDG消化），95°C 30 s，随后45个循环的95°C 10 s和60°C 20 s。

结果

所建立的多重qPCR标准曲线线性良好，相关系数R²均≥0.995，扩增效率在89.2%–108.9%之间。检测限分别为：cGPV 10² copies/μL，MDPV 10¹ copies/μL，MDGPV 10² copies/μL，SBDSV 10³ copies/μL。组内与组间变异系数（CV）均低于2%，显示该方法重复性良好。

特异性试验表明，该方法仅对目标病毒产生特异荧光信号，与其他水禽常见病毒无交叉反应。即使在混合模板中仍能准确区分各病毒类型，未出现非特异性扩增。

在337份临床样本中，该多重qPCR方法共检出阳性样本194份（58%），高于常规PCR的182份（54%）。病毒型别分布显示：MDGPV为优势流行株，检出132份（39.2%），且主要集中于番鸭；MDPV检出30份（8.9%），cGPV检出15份（4.5%，仅见于鹅），SBDSV检出17份（5.0%，多见于半番鸭与北京鸭）。值得注意的是，首次在雏鹅中检出MDGPV，提示该病毒可能存在跨种传播潜力。此外，发现27份样本存在MDGPV与MDPV混合感染，该多重方法能清晰鉴别这类共感染情况。

讨论

水禽细小病毒因高频重组和突变而不断进化，例如MDGPV即为MDPV与cGPV的自然重组体，其基因组部分区段被cGPV相应序列替换。这类重组事件可能改变病毒的宿主适应性、毒力和传播特性，给水禽养殖业带来持续威胁。

本研究开发的四重TaqMan-MGB qPCR方法有效解决了传统方法在鉴别高度同源病毒方面的局限性。MGB探针技术的应用使得该方法能够区分单核苷酸多态性（SNP），例如SBDSV与cGPV探针间仅一个碱基差异，但仍可特异性识别。该方法灵敏度高、通量大，适用于临床样本的高通量筛查和流行毒株监测。

流行病学结果显示，MDGPV已成为当前中国南方番鸭群中的主导流行株，且与MDPV共感染现象普遍，暗示二者可能存在生物学上的相互作用。cGPV仍保持对鹅的宿主特异性，而SBDSV则呈现更宽的宿主范围，提示其进化轨迹与致病机制可能有别于其他WPVs。

结论

本研究成功建立了一种四重TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法，可实现cGPV、MDPV、MDGPV和SBDSV的同步快速检测与分型。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好，显著提升了临床样本的检出率与混合感染识别能力，为水禽细小病毒病的诊断、监测与防控提供了有力的技术工具。