利用细菌脂多糖内毒素对具有应激表型的奶牛外周血单核细胞的应激反应进行评估

《Journal of Dairy Science》：Assessment of heat stress response of peripheral blood mononuclear cells from dairy cows' stress phenotyped using bacterial lipopolysaccharide endotoxin

热应激对奶牛外周血单核细胞的影响及应激反应类型差异研究。通过体外热休克挑战，评估了低（LSR）、中（MSR）、高（HSR）应激响应奶牛PBMC的凋亡、坏死、增殖及炎症因子（IFN-γ、IL-8、MCP-1）和热休克蛋白（HSP70、HSP90）表达差异。结果显示，MSR组细胞凋亡较少且HSP70、HSP90表达显著升高，而LSR组坏死率更高，HSR组凋亡率增加。提示不同应激响应类型的PBMC对热应激具有特异性应答，中应激 responder可能通过增强HSP表达增强热耐受性。

　　在当今全球气候变化日益加剧的背景下，热应激（Heat Stress, HS）已成为影响畜牧业，尤其是奶牛养殖的重要问题。随着全球气温持续上升，预计到2050年，全球气温将比当前上升超过2°C，而高温与高湿度的结合则可能显著增加极端天气事件的发生频率和强度，如热浪和干旱等。这些变化对奶牛的健康、生产性能以及整体福利构成了严峻挑战。HS不仅会导致奶牛的代谢紊乱和生理机能下降，还可能引发一系列免疫反应，进而影响其对疾病的抵抗力和生产效率。因此，理解奶牛在热应激下的生理和免疫反应机制，对于开发有效的应对策略至关重要。

本研究旨在探讨不同热应激反应表型的奶牛其外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）在体外热应激挑战（Heat Shock Challenge, HSC）下的反应差异。研究对象是从260头奶牛中挑选出的30头，这些奶牛在6至8个月龄时根据其对大肠杆菌（Escherichia coli）脂多糖（LPS）的4小时血清皮质醇反应被分为高热应激反应者（High Stress Responder, HSR）、中等热应激反应者（Middle Stress Responder, MSR）和低热应激反应者（Low Stress Responder, LSR）。通过这一分类，研究人员希望揭示个体间对热应激的差异性反应，从而为未来的选育工作提供科学依据。

在实验设计方面，研究人员采用了严格的流程以确保数据的可靠性和可重复性。首先，从奶牛中采集血液样本，并立即进行PBMC的分离。分离过程在低温条件下进行，以防止细胞受损。分离后的PBMC被分为两组：一组接受热应激挑战（HSC），另一组作为对照（Control, CNT）。热应激挑战组的细胞在42°C下培养4小时后，再恢复至37°C，而对照组则始终维持在37°C。随后，研究人员通过多种实验方法评估PBMC的细胞活性、增殖能力、细胞死亡类型以及基因表达和细胞因子、趋化因子的分泌情况。

在细胞活性评估中，研究发现HSR和MSR组的PBMC在HSC后出现显著的细胞凋亡（apoptosis）增加，而LSR组则表现出更高的细胞坏死（necrosis）水平。这一结果表明，不同热应激反应表型的奶牛在面对热应激时，其免疫细胞的反应机制存在差异。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，有助于清除受损细胞，而细胞坏死则是一种非程序性死亡，可能引发炎症反应。因此，这种差异可能反映了不同个体在应对热应激时的免疫调节能力不同。

在细胞增殖实验中，所有组别在HSC后均显示出细胞增殖能力的下降，但各组之间的差异并不显著。这表明，尽管热应激对细胞增殖有抑制作用，但这种影响可能在不同表型的奶牛中具有一定的普遍性。然而，HSR组的细胞增殖抑制更为明显，这可能与它们较高的皮质醇水平有关。皮质醇作为重要的应激激素，可能通过影响细胞的增殖信号通路，进而对免疫细胞的功能产生负面影响。

在细胞因子和趋化因子的分析中，研究发现HSC对不同表型的PBMC影响各异。例如，HSR组的IFN-γ浓度在HSC后显著升高，而LSR组则表现出较高的IFN-γ分泌水平。IFN-γ作为一种促炎性细胞因子，主要由TH1细胞产生，其浓度的变化可能反映了不同表型奶牛在热应激下的免疫反应差异。此外，研究还发现，HSC对IL-8和MCP-1（CCL2）的分泌有显著影响，其中HSR组的IL-8浓度在HSC后显著下降，而MSR组的IL-8浓度在对照条件下高于LSR组。这些结果提示，热应激可能通过不同的机制影响细胞因子的分泌，进而影响免疫系统的整体功能。

在基因表达方面，研究发现MSR组的PBMC在HSC后表现出显著的HSP70和HSP90基因表达增加，而LSR组则显示出HSPB1基因的显著上调。HSP70和HSP90作为重要的热休克蛋白，具有保护细胞免受热应激损伤的功能，它们能够通过协助蛋白质的折叠和降解，维持细胞的结构稳定性和功能正常。而HSPB1（HSP27）则在氧化应激条件下发挥抗氧化作用，其表达增加可能表明LSR组的PBMC在热应激下经历了更严重的氧化损伤。这些基因表达的变化可能反映了不同表型奶牛在热应激下的分子机制差异。

进一步的讨论指出，热应激对免疫系统的干扰可能涉及多种复杂的生理和分子机制。例如，HS可能通过破坏肠道屏障完整性，导致脂多糖（LPS）等内毒素进入血液循环，进而引发全身性炎症反应。这种炎症反应可能进一步影响体温调节，导致体温升高和散热能力下降，形成恶性循环。此外，HS可能通过激活下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal, HPA）轴，增加皮质醇的分泌，从而抑制免疫反应，增加炎症水平，甚至引发氧化应激。

研究还强调了热应激反应表型在奶牛选育中的潜在应用价值。通过识别和选育具有较强热应激耐受能力的个体，可以有效提高奶牛在高温环境下的生存能力和生产性能。例如，携带“光滑毛”基因型的奶牛已被证明具有更好的体温调节能力，能够减少热应激引起的生理紊乱。此外，研究还指出，某些免疫反应较强的奶牛在热应激条件下表现出更高的HSP70表达水平，这可能与它们的热应激耐受能力相关。因此，未来的选育工作应考虑将热应激反应表型作为重要的选育指标，以提高奶牛的热应激耐受能力。

总体而言，本研究揭示了不同热应激反应表型的奶牛在面对热应激时的免疫细胞反应差异。这些发现不仅有助于理解热应激对奶牛免疫系统的影响机制，也为开发基于遗传选育的热应激应对策略提供了科学依据。未来的研究应进一步探索这些反应在体内的表现，并结合更多的临床数据和实际生产环境，以评估这些表型在实际应用中的有效性。此外，还需要深入研究热应激与免疫反应之间的相互作用，以及热休克蛋白在其中的作用机制，从而为畜牧业提供更加全面和科学的应对方案。