多模态光声-荧光显微镜技术用于疾病模型中的定量吸收系数绘图及精确病灶追踪

《Optics & Laser Technology》：Multimodal photoacoustic-fluorescence microscopy for quantitative absorption coefficient mapping and precision lesion tracking in disease models

定量多模态成像系统融合光学分辨率超声显微成像（OR-PAM）与荧光成像，通过蒙特卡洛-有限元素方法（MC-FEM）实现光学吸收系数（μa）的绝对定量重建，解决了传统OR-PAM依赖血红蛋白参数的局限性。实验验证系统在炎症（μa 7.9%↑）、肿瘤（μa 5.5%↑）和血脑屏障（μa=235 cm?1）中的高灵敏度与空间特异性，为病理血管鉴别和动态监测提供新工具。

　　这项研究提出了一种结合光学分辨率光声显微镜（OR-PAM）与荧光显微镜的集成多模态成像系统，旨在对生物组织中的光学吸收系数进行定量映射。该系统通过将荧光成像的分子特异性与OR-PAM在深度分辨方面的定量能力相结合，实现了对病变区域的精确定位以及生理状态的监测。系统引入了一种新颖的重建算法，该算法融合了蒙特卡洛光传输模拟与定制的OR-PAM技术，从而能够实现绝对光学吸收系数的测定，这是荧光显微镜无法实现的功能，也区别于传统的OR-PAM方法。

为了验证这一系统，研究团队在三个模型系统中进行了实验：炎症监测、肿瘤追踪和脑血管成像。这些实验结果显示了系统在病理组织识别方面的潜力。在炎症监测中，感染部位的光学吸收系数在12小时内增加了7.9%（258 cm?1与正常血管的239 cm?1相比，p < 0.001）。在肿瘤追踪方面，肿瘤血管的吸收系数比正常组织高5.5%（252 cm?1 vs. 237 cm?1）。脑血管成像实验则在血脑屏障打开后实现了235 cm?1的吸收系数量化。这些结果表明，荧光显微镜在分子追踪方面具有卓越的能力，而OR-PAM则能够提供对病理组织进行区分所需的定量吸收系数差异，为基础研究和临床诊断提供了强有力的工具。

系统设计基于现有的荧光显微镜平台（Eclipse Ni-U，Nikon Inc.），通过引入脉冲激光（波长：532 nm；脉冲宽度：1 ns；重复率：最高可达5 KHz）对组织进行照射。激光束首先经过一个光学子系统（包括中性密度滤光片、凸透镜、针孔和光纤），然后通过光纤传输，利用振镜（GS）改变其传播方向，最终被聚焦到显微镜的物镜和目镜系统上。同时，一个二维电机（M1和M2）用于扫描组织。超声换能器（UT）设计为具有0.5 mm中心孔径和80%带宽，工作频率为50 MHz，焦距为10 mm。样本放置在电动升降平台（LP）上，成像区域与水槽底部的薄膜（TF）紧密耦合，整个水槽系统和物镜台（OT）可以在电机M1和M2的控制下进行x-y扫描，当前的电机扫描方法需要15-20分钟来扫描一个9 mm × 9 mm的区域。

系统的重建方案结合了两种互补的计算方法：有限元建模（FEM）用于模拟声波传播，以及通过MCML软件包实现的蒙特卡洛（MC）光传输模拟。这种双方法框架结合了FEM在解决光声波方程方面的精确性和MC在生物组织中光子迁移建模的严谨性，从而实现了对光学吸收特性的全面定量重建。FEM组件准确捕捉了声波动态，而MC模拟计算了光的荧光分布，共同提供了完整的光声显微镜过程的物理模型。

在第一步中，系统通过光声数据重建获得归一化的吸收光能密度（Ψ^m）。同时，通过MC模拟计算了组织内的吸收光能密度（Ψ^c），这为后续的定量吸收系数重建提供了关键输入。在第二步中，采用迭代最小二乘优化方法来优化吸收系数（μ_a），初始猜测为100 cm?1，步长为5 cm?1。如果误差足够小，迭代过程停止；否则，吸收系数通过公式μ_a = μ_a0 + Δμ_a (j-1) 更新，其中j为迭代次数。整个过程如图2所示。

对于实验验证，研究团队使用了单只小鼠作为每个模型系统的样本，每个条件进行10个区域的测量，以评估个体一致性。在模型实验中，使用了含有印度墨水（吸收剂）和Intralipid（散射剂）的固体圆柱形幻影，直径为1 cm，其中嵌入了1 mm直径的吸收体。背景幻影的吸收系数为0.02 cm?1，散射系数为1 cm?1，而目标吸收体的吸收系数为0.4 cm?1，散射系数为2 cm?1。实验结果表明，系统能够准确地重建吸收系数，其平均值为0.395 cm?1，与实际值0.4 cm?1相比，偏差仅为1.25%。这些结果初步验证了该方法在幻影实验中的准确性和可行性。

在体内验证研究中，研究团队利用定制的多模态成像系统对小鼠耳部的炎症进展进行了定量监测。通过同时进行光声显微镜和荧光成像，系统能够捕捉到感染部位的动态病理变化。例如，光声显微镜显示感染部位的毛细血管密度在1小时内迅速增加，而荧光成像则显示炎症区域的扩展，从1小时的0.3 ± 0.05 mm2增加到12小时的1.5 ± 0.1 mm2（5.0倍）。定量分析显示，感染部位的吸收系数在532 nm波长下显著增加，从基线的239 cm?1（代表3.8%的增加）增加到12小时的258 cm?1（代表7.9%的增加），p < 0.001，Cohen's d = 3.3。这些结果表明，系统能够敏感地检测到病理变化，即使在单个小鼠模型下也能证明其方法的可行性。

在肿瘤追踪实验中，系统对GFP表达的小鼠模型进行了连续的光声显微镜和荧光成像，间隔72小时从接种后第3天到第12天。系统捕捉了肿瘤发展的三个关键方面：（1）体积呈指数增长，从第6天的8 ± 0.5 mm3增加到第12天的87.5 ± 3.8 mm3（p < 0.001）；（2）荧光信号面积逐步扩大，从10 ± 0.5 mm2增加到35 ± 1.5 mm2，强度增强4.2 ± 0.3倍（p < 0.001）；（3）肿瘤血管的吸收系数显著高于正常组织（250-252 cm?1 vs. 237 ± 2 cm?1，p < 0.001）。通过多模态叠加，系统展示了血管密度（光声信号，红色）与肿瘤细胞（荧光信号，绿色）之间的空间一致性，进一步验证了其在肿瘤监测中的潜力。

在脑血管成像实验中，系统通过结合荧光和光声显微镜成功可视化了小鼠的脑血管。在血脑屏障（BBB）被暂时破坏后，吲哚菁绿（ICG）能够渗透进入脑组织。结果显示，荧光成像清晰地描绘了大脑的结构轮廓，而光声显微镜则揭示了详细的脑血管网络，其平均吸收系数在532 nm波长下为235 ± 3 cm?1。这些结果表明，系统能够准确地测量脑血管的吸收系数，并与理论值（230.5 cm?1）相比，偏差在2.2%至4.99%之间，验证了其在体内成像中的准确性。

研究团队还强调了系统在多模态成像中的优势，即通过分子特异性与定量血管评估的结合，提供了对神经血管研究的卓越能力。然而，该系统也存在一些局限性，例如在单波长下的吸收系数量化可能无法完全区分非血红蛋白吸收体，需要进一步的光谱解混。此外，系统的光学穿透深度约为2 mm，限制了其对深层组织的成像能力，尽管混合AR-PAM/OR-PAM架构可能扩展这一范围至5-10 mm，但需要权衡分辨率和信号衰减的问题。对于血脑屏障研究，聚焦超声方法在临床转化方面面临安全风险、操作依赖性和监管障碍等挑战。此外，当前的扫描时间（每个9 mm × 9 mm区域约20分钟）和小样本量（每模型仅1只小鼠）限制了系统的吞吐量和跨个体差异分析的可行性。虽然MC-FEM框架能够提供准确的定量结果，但计算时间仍然是实际应用中的一个考虑因素。未来的工作可以探索将先进的深度学习重建技术（如物理嵌入网络）整合到系统中，以显著提高处理速度，同时保持模型的物理准确性。研究团队还计划优化AR-PAM/OR-PAM融合，以实现深度与分辨率的平衡，探索非侵入性血脑屏障调控方法，并进行硬件微型化，这些都是向临床应用迈出的重要步骤，其中表浅成像提供了最大的实用性。