胆管细胞外泌体miR-381-3p通过靶向Klf6促进肝星状细胞活化与胆汁淤积性肝纤维化的机制研究

本研究聚焦慢性胆汁淤积性肝病(CCLD)中肝星状细胞(HSCs)活化的调控机制，发现胆管细胞来源的外泌体携带miR-381-3p，通过靶向抑制转录因子Klf6的表达，显著促进HSCs活化及肝纤维化进程。该研究为CCLD的分子机制提供了新见解，并为靶向外泌体miRNA治疗肝纤维化提供了潜在策略。

　　

慢性胆汁淤积性肝病（Chronic Cholestatic Liver Diseases, CCLD）是一类以胆汁流动持续受阻为特征的肝脏疾病，常见类型包括原发性胆汁性胆管炎（PBC）和原发性硬化性胆管炎（PSC）。患者因胆汁酸积聚、慢性炎症及进行性纤维化而面临肝功能衰竭的风险。肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）的激活被认为是肝纤维化进程中的核心事件——活化的HSCs转化为肌成纤维细胞，大量分泌胶原等细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM），最终导致肝脏结构破坏和功能丧失。尽管现有药物如熊去氧胆酸（UDCA）可调节胆汁酸代谢，但仍无法有效逆转纤维化，因此探索HSCs活化的深层机制、开发抗纤维化新靶点，成为当前研究的重要方向。

近年来，外泌体（exosomes）作为细胞间通讯的关键载体备受关注。这些直径约30-150纳米的囊泡可携带蛋白质、脂质及核酸等生物活性分子，参与多种病理生理过程。在肝脏疾病中，胆管细胞来源的外泌体及其所负载的微小RNA（microRNAs, miRNAs）是否调控HSCs活化，尚不明确。为此，研究团队在《Regenerative Therapy》发表论文，深入揭示了胆管细胞外泌体中的miR-381-3p通过靶向Klf6分子促进HSCs活化与肝纤维化的作用机制。

为开展本研究，作者运用了以下关键技术方法：通过胆管结扎（Bile Duct Ligation, BDL）构建小鼠胆汁淤积模型；采用超速离心法分离小鼠大胆管细胞（MLE）来源的外泌体，并通过透射电镜、纳米颗粒追踪技术和Western blot进行鉴定；利用miRNA微阵列芯片筛选外泌体中差异表达的miRNA；通过双荧光素酶报告实验和RNA Pull-down验证miR-381-3p与靶基因Klf6的结合关系；使用RT-qPCR和Western blot分析纤维化标志物表达；并通过细胞转换技术实现miR-381-3p和Klf6的过表达或敲低，以进行功能回复实验。

3.1. Identification of MLE-derived exosomes

研究人员首先从小鼠大胆管细胞（MLE）中成功分离出外泌体，透射电镜显示其呈典型杯状或圆形双层膜结构，纳米颗粒追踪分析表明粒径主要分布于100-200纳米，Western blot验证了外泌体标志蛋白CD63和TSG101的表达，证实外泌体提取成功。

3.2. BDL-MLE-exosomes promoted HSCs activation and hepatic fibrosis

在TGF-β诱导的HSCs活化模型中，BDL-MLE来源的外泌体显著增强了纤维化标志物（包括α-SMA、Collagen I、Acta2、Loxl2等）的mRNA和蛋白表达水平，表明这些外泌体具有促纤维化作用。

3.3. Dicer knockout decreased activation and hepatic fibrosis in BDL-MLE-exosomes-treated HSCs

由于Dicer是miRNA成熟过程中的关键酶，研究人员发现敲低Dicer后，纤维化相关基因的表达显著下降，提示外泌体中的miRNA可能参与了HSCs的活化调控。

3.4. BDL-MLE-exosomes-treated HSCs showed upregulated miR-381-3p expression

通过miRNA芯片分析和RT-qPCR验证，发现BDL-MLE外泌体中miR-381-3p表达显著上调，且经外泌体处理的HSCs中该miRNA水平也明显升高，说明miR-381-3p可能通过外泌体从胆管细胞传递至HSCs。

3.5. Klf6 is a target gene of miR-381-3p

通过TargetScan数据库预测并结合双荧光素酶报告实验和RNA Pull-down，证实Klf6是miR-381-3p的直接靶标。抑制miR-381-3p后可显著上调Klf6的表达。

3.6. Klf6 overexpression reversed the promoted HSCs activation and hepatic fibrosis induced by miR-381-3p overexpression

在功能回复实验中，过表达miR-381-3p可进一步促进纤维化基因表达，而同时过表达Klf6则能有效逆转该效应，说明Klf6在抑制HSCs活化和肝纤维化中起到关键作用。

本研究系统阐明了在胆汁淤积性肝纤维化中，胆管细胞通过外泌体传递miR-381-3p至HSCs，靶向抑制Klf6表达，从而促进HSCs活化与纤维化进程的分子机制。这一发现不仅深化了对CCLD发病机制的理解，也为开发以外泌体miRNA或Klf6为靶点的抗肝纤维化策略提供了重要理论依据。值得注意的是，Klf6在不同疾病背景下的作用可能存在差异，本研究首次在胆汁淤积模型中揭示了miR-381-3p/Klf6轴的特异性调控功能，为后续转化研究和个体化治疗指明了新方向。