基于纸基纳米生物传感器与图像定量技术的microRNA-499无扩增检测及其在心肌梗死早期诊断中的应用

本文创新性地开发了一种功能化金纳米颗粒（AuNP）的纸基纳米生物传感器，通过热力学优化的发夹分子信标实现心肌梗死（MI）关键生物标志物miR-499的高灵敏（检测限10 fM）、高特异性检测。该平台结合荧光成像与OpenCV图像分析流程，无需核酸扩增（amplification-free）或复杂仪器，在室温下稳定>50天，为资源有限地区提供了一种低成本、可定量的床旁检测（POC）新方案。

　　

Reagents and Materials

所有寡核苷酸均由Microsynth AG（瑞士）提供并经过HPLC纯化。金(III)氯化物三水合物（HAuCl₄·3H₂O）和氰化钾（KCN）购自Sigma-Aldrich；柠檬酸钠、柠檬酸、氢氧化钠、氯化钠和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）购自Merck；Unisart? CN 150硝酸纤维素膜购自Sartorius。所有实验均使用去离子水。

In Silico Design of the DNA Beacon Probe

所有序列列于表1。mFold预测DNA信标可形成稳定的茎环发夹结构，具有完全配对的9碱基对茎部（ΔG = –9.03 kcal/mol）和较不稳定的替代折叠（图1A）。DINAMelt同源二聚化模拟表明，在25°C下几乎所有探针均保持单体折叠发夹状态，无同源二聚体形成（图1B）。NUPACK验证了这些结果，得到了匹配的最低自由能结构（ΔG = –8.74 kcal/mol，图S2A）和碱基配对概率。

Discussion

利用UNAfold和NUPACK进行的热力学建模共同指向一个具有9碱基对茎部（ΔG ≈ –9 kcal/mol，图1A和图S2A、B）且环区与靶标miRNA完全互补的发夹信标。该设计确保在无靶标情况下闭合的信标结构占绝对优势，从而最大程度降低背景荧光，而探针-靶标双链体形成的自由能增益（ΔG ≈ –25至–29 kcal/mol，图1C和图S2C、D）则在靶标结合时驱动信标快速“开启”并产生信号。

Conclusion

总之，我们设计了一种低成本纸基纳米生物传感器，它利用与发夹分子信标结合的金纳米粒子（AuNP），实现了对心肌梗死早期生物标志物miRNA-499的超灵敏、无扩增检测。该平台将简单的荧光成像与自动化图像分析流程相结合，无需冷链储存或复杂仪器即可产生稳健、可重复的信号。该纳米生物传感器在室温下保持稳定性和性能超过50天，并通过台式读板器和标准桌面摄像头验证了其检测能力，检测限低至10 fM，线性范围跨越四个数量级（10 fM – 100 pM）。其卓越的特异性可清晰区分单碱基和多重碱基错配靶标。这些特性使其特别适合资源有限环境下的床旁（POC）心肌梗死早期诊断和分散式筛查。未来的工作将集中于将该检测集成到全血样本即时检测设备中，并探索其与其他心脏富集miRNA（如miR-208b）多重检测的兼容性。