宿主-寄生蜂抗菌肽协同互作：揭示内寄生蜂成功发育的免疫生存策略

本综述系统阐述了小菜蛾（Plutella xylostella）与其内寄生蜂菜蛾盘绒茧蜂（Cotesia vestalis）互作过程中抗菌肽（AMPs）的免疫调控机制。研究发现寄生初期宿主AMPs表达被抑制，但随着寄生进程，部分AMPs（如gloverin）对病原感染极为敏感且对宿主存活至关重要。尤为重要的是，寄生蜂畸形细胞表达的特异性抗菌肽hymenoptaecin具有广谱抗菌活性，能显著降低寄生宿主血淋巴中细菌载量并提高存活率。该研究为宿主-寄生蜂免疫互作提供了新视角，揭示了AMPs在维持寄生系统稳定中的关键作用。

　　

宿主与寄生蜂抗菌肽相互作用的免疫动态

寄生是一种共生关系，其中寄生者以宿主为代价获益。寄生蜂（内寄生蜂）将卵产在其他无脊椎动物体内或体表，其后代发育对宿主是致命的。理论上，雌蜂叮咬造成的伤口和引入的寄生蜂卵会激活宿主的免疫反应。然而，寄生蜂通过一系列寄生蜂衍生因子（包括毒液、共生多DNA病毒（PDV，最近称为polydnaviriformes）、来源于寄生蜂卵胚外细胞的畸形细胞，甚至幼虫分泌物）来共同逃避或抑制宿主免疫反应。

抗菌肽（AMPs）是一类小的、带正电荷的肽，通过靶向细胞膜或某些细胞内位点来杀死微生物，并对先天免疫反应贡献巨大。大多数AMP基因由细菌感染诱导，受Toll和Imd NF-κB通路调控。因此，AMPs常被用作监测这些免疫通路活性的指标，尤其是在昆虫中。相应地，上调的AMPs在提高各种受感染宿主的存活率方面起着至关重要的作用。

小菜蛾（Plutella xylostella）（鳞翅目；菜蛾科）是一种许多经济上重要的十字花科蔬菜（Brassicaceae）的 notorious 食草动物。管理小菜蛾相当具有挑战性，因为各种田间种群已对多种杀虫剂（包括苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）毒素）产生抗性。寄生蜂是抑制小菜蛾种群的有效生物防治剂。菜蛾盘绒茧蜂（Cotesia vestalis）Haliday（膜翅目：茧蜂科）是中国小菜蛾的主要幼虫内寄生蜂。多项研究表明，C. vestalis 寄生抑制了小菜蛾的细胞免疫反应和体液免疫反应。免疫抑制涉及减少宿主血细胞、触发细胞凋亡、抑制黑化以及下调某些AMPs的产生。

两种不同的方式：寄生小菜蛾AMPs对微生物感染的反应

小菜蛾中已鉴定出四种AMPs，即cecropin、defensin、gloverin和moricin。为了评估AMPs在宿主-寄生蜂系统中的作用，通过qPCR检测了寄生和未寄生小菜蛾中五种选定的AMPs的表达水平。结果显示，所有五种AMPs的表达在寄生后一天（1 dpp）均被显著抑制，随后在寄生后期恢复或上调，其中Px-cecropin2（Px-Cec2）和Px-cecropin3（Px-Cec3）从2 dpp开始上调，gloverin从3 dpp开始上调，defensin和moricin在5 dpp上调。为了弄清楚寄生宿主对细菌攻击的免疫反应，在寄生后三天分别用大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染宿主幼虫。结果显示，所有五种AMPs在未寄生宿主中对细菌感染都很敏感，其中Px-Cec2和Px-Cec3显示最显著的升高。在寄生宿主中，这些基因的趋势出现分化：Px-Cec2和Px-Cec3的表达相对稳定或轻微增加，而其他三个基因则显著上调，表明defensin、gloverin和moricin在寄生宿主中很敏感。

寄生宿主在细菌攻击后比未寄生宿主存活更久

为了进一步检验AMPs在寄生小菜蛾中的作用，在2 dpp（在其表达上调之前）使用dsPx-Glo敲低了Px-gloverin（Px-Glo）的表达。24小时后，Px-Glo的表达水平被显著抑制，RNA干扰效率约为85%。Px-Glo对细菌刺激的反应也减弱了。记录dsRNA处理后小菜蛾应对细菌攻击的存活率。与dsGFP处理组相比，Px-Glo敲低显著降低了未寄生和寄生宿主幼虫的存活率。值得注意的是，经dsPx-Glo处理的未寄生宿主在PBS处理后存活率最低，表明gloverin在小菜蛾的免疫反应中起着关键作用。我们还注意到，经dsPx-Glo处理的寄生宿主的存活率高于未寄生宿主。在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染后也观察到类似现象。

Hymenoptaecin是小菜蛾-C. vestalis系统中的主要免疫效应因子

已知畸形细胞表达免疫相关基因并表现出抗菌活性。先前已在C. vestalis中鉴定出两种AMPs（Defensin和hymenoptaecin）。总共选择了四种特征性的defensins（Cv-def-1, -2, -3和CvT-def-1）和一种推定的hymenoptaecin（Hym）进行进一步分析。这四种defensins在C. vestalis的不同发育阶段表现出不同的表达模式：Cv-def1和Cv-def2在雄成虫中表达水平高，而Cv-Def-3在3龄幼虫中表达突出。CvT-def-1从3龄幼虫开始高表达，并在雄成虫中达到峰值。与defensins不同，Hym特异性表达于畸形细胞中，并且其趋势随着细胞成熟而增加。

为了测试C. vestalis幼虫在寄生宿主受到挑战时是否会参与宿主-寄生蜂系统，检测了感染大肠杆菌或金黄色葡萄球菌6小时后C. vestalis幼虫和畸形细胞中AMP基因的表达。除CvT-def-1外，病原菌感染并未刺激C. vestalis幼虫中其他三种defensins的表达，而Hym的转录本未被检测到。在畸形细胞中，对细菌攻击的免疫反应要复杂得多。与对照组相比，感染大肠杆菌后Cv-def-1上调，Cv-def-3被金黄色葡萄球菌诱导，并且响应大肠杆菌，CvT-def-1的表达有轻微下降。Cv-def-2和Hym均被两种细菌刺激，其中Hym与对照组相比显示出两到三倍的升高。

接下来检测了免疫缺陷小菜蛾中Cv-def-2和Hym对细菌感染的反应。Cv-def-2转录本在金黄色葡萄球菌感染后显著诱导，但对大肠杆菌不敏感。细菌感染强烈诱导了Hym的转录本，比对照组高出约7~9倍。鉴于在细菌攻击后，dsGloverin处理的小菜蛾中寄生宿主表现出更高的存活率，畸形细胞表达的AMPs的诱导，特别是畸形细胞特异性表达的hymenoptaecin，可能极大地促进了寄生宿主的存活。

Hymenoptaecin的特性

尽管有四种defensins，但hymenoptaecin的序列和抗菌活性尚未被表征。对C. vestalis基因组的相似性搜索鉴定出两个hymenoptaecin样肽，编码相同的氨基酸。Hym的开放阅读框（ORF）为480个核苷酸，编码159个氨基酸（aa）残基，具有一个信号肽（20 aa）、一个富含脯氨酸的前肽（36 aa，38%脯氨酸）和一个富含甘氨酸的成熟肽。作为一种富含甘氨酸的AMP，Hym成熟肽中的甘氨酸含量为10%。预测的成熟肽分子量为15.75 kDa，等电点（pI）为9.52。与其他膜翅目物种的hymenoptaecin类似，Hym的推定的前肽和成熟肽由一个保守的furin识别基序RX(K/R)R分隔，该基序可能作为胞内furin酶原激活的推定识别切割位点。此外，该前肽与其他已知的富含脯氨酸的AMPs（包括drosocin和apidaecin）具有可检测的相似性（约30%）。

基于来自膜翅目（尤其是寄生蜂）的同源序列构建了hymenoptaecin的最大似然系统发育树。结果显示hymenoptaecin在膜翅目中保守，并且来自茧蜂科的hymenoptaecin形成一个簇。基因组结构显示大多数hymenoptaecins至少包含一个内含子。Cotesia中的hymenoptaecins具有反向重复的特征，而其他物种（如N. vitripennis和Leptoptaecin heterotoma）中的hymenoptaecin是串联重复，表明Cotesia中hymenoptaecin是独立重复的。

Hymenoptaecin在体外和体内显示出抗菌肽活性

为了检测hymenoptaecin的活性，用大肠杆菌BL21异源表达并纯化了重组hymenoptaecin（mHym）。带有His标签的mHym约为20 kDa。用凝血酶去除His标签后，获得了一个约16 kDa的蛋白质。

然后检测了纯化的mHym对三种革兰氏阴性菌（大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium））、三种革兰氏阳性菌（藤黄微球菌（M. luteus）和金黄色葡萄球菌）和一种真菌菌株（白念珠菌（M. albican））的作用，以抗生素作为阳性对照，含有0.01%乙酸的PBS作为阴性对照。抑菌圈结果显示Hym对革兰氏阳性菌（藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌）和真菌（白念珠菌）有活性。Hym对藤黄微球菌和白念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为8.12和16.25 μg/ml。除了这三种阳性菌外，生长曲线显示hymenoptaecin在16.25 μg/ml浓度下对大肠杆菌有活性，但对鼠伤寒沙门氏菌没有活性。

在体内，通过免疫组化和使用针对mHym的多克隆抗体进行Western blotting证实了Hym在畸形细胞中的表达，证明了hymenoptaecin分泌到寄生宿主幼虫的血淋巴中。共注射mHym显著降低了细菌载量，这通过CFU计数和小菜蛾血淋巴中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的16S rRNA水平证明。存活测试还显示，与仅注射大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的幼虫相比，共注射细菌和mHym的幼虫存活率显著更高。这些结果表明，畸形细胞表达的hymenoptaecin在小菜蛾-C. vestalis系统的免疫反应中作为抗菌因子起作用。

讨论

抗菌肽是免疫系统中重要的效应因子。它们广泛存在于生物界，在缺乏适应性免疫的昆虫生存中发挥着极其重要的作用。小菜蛾中已鉴定出几种AMPs，根据序列相似性分为四个家族：cecropin、moricin、gloverin和defensin。这些AMPs具有广谱抗菌活性，由细菌感染诱导，并可能受保守的NF-κB信号通路调控，表明这些AMPs参与了小菜蛾的免疫反应。我们的研究表明，在C. vestalis寄生初期，所有四种AMPs的功能都被禁用。与未寄生宿主不同，感染后寄生宿主中AMP表达的调控很复杂，涉及宿主免疫反应和寄生因子（BV和畸形细胞）的影响。最近的研究表明，携带BV的寄生蜂通过BV表达的ankyrin抑制NF-κB活化并抑制宿主AMPs的表达。先前的研究也表明，C. vestalis（= C. plutellae）bracovirus使小菜蛾中cecropin的表达失效。这些证据表明CvBV参与了禁用小菜蛾保守的NF-κB免疫信号。令人惊讶的是，随着寄生过程的进行，寄生幼虫中AMPs的表达得到恢复，甚至在某些时间点上调，这可能是由于BV抑制效果的减弱，因为大多数BV基因的表达表现出时空变异。

两个cecropins的相对稳定表达以及寄生宿主幼虫在细菌感染后moricin、defensin和gloverin的剧烈诱导表明寄生作用对AMP基因表达进行了精确调控。在这些AMPs中，gloverin的表达对刺激极其敏感，包括PBS注射、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌攻击，在寄生宿主幼虫中都是如此。在家蚕（B. mori）和烟草天蛾（M. sexta）中，gloverin受Toll通路调控，而小菜蛾中肠的gloverin响应IMD干扰，表明gloverin可能受多种通路调控。尽管其在寄生宿主中的作用略小于未寄生宿主，但dsGloverin处理的小菜蛾幼虫的较高死亡率表明gloverin在宿主免疫反应中起着至关重要的作用。

由于C. vestalis寄生减少了血细胞总数并抑制了小菜蛾幼虫的黑化，寄生宿主在细菌攻击后会有更高的死亡率。然而，未寄生小菜蛾幼虫（NP-dsGloverin）的较高死亡率与缺乏畸形细胞的寄生宿主一致，表明畸形细胞相关因子可能补偿免疫抑制并提高寄生宿主的存活率。作为一个宿主-寄生蜂系统，细菌感染引发了畸形细胞和宿主中的AMP产生，但蜂幼虫中的转录本相对稳定。先前的研究表明，畸形细胞通过表达AMPs和serpins的新功能化表现出抗菌活性。这些证据表明，畸形细胞表达的免疫效应因子对于宿主-寄生蜂系统战胜细菌感染至关重要。

Hymenoptaecin已在蜜蜂和蚂蚁中得到很好的表征。它首先在意大利蜜蜂（Apis mellifera）中被鉴定出来，可以在细菌包膜上形成孔洞，从而抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的活力。它是一种主要存在于膜翅目昆虫中的富含甘氨酸的抗菌肽。大量调查表明，hymenoptaecin响应病原体感染和环境压力，即热和农药处理。在中红侧沟茧蜂（Microplitis mediator）成虫中，两种hymenoptaecins的表达水平在细菌攻击后上调，而hymenoptaecin在寄生过程中的作用尚未见报道。在本研究中，来自C. vestalis的hymenoptaecin在N端附近包含一个富含脯氨酸的结构域，在C端附近包含一个富含甘氨酸的结构域，与来自N. vitripennis的hymenoptaecin-1显示出高度相似性。对微生物（革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌和真菌）具有活性，hymenoptaecin在畸形细胞中的急剧增加以及mHym处理宿主的更高存活率表明它在寄生宿主的存活中起着至关重要的作用，补偿了BV介导的免疫抑制。先前的研究已经证明了hymenoptaecin与其他AMPs（如abaecins）之间的增强相互作用。我们还观察到Cvhym的富含脯氨酸的前肽与来自Nasonia vitripennis hymenoptaecin的pronavicin高度保守，后者表现出抗菌活性。这表明天然存在的hymenoptaecin可能具有增强的抗菌活性。关于宿主AMPs的作用，在gloverin敲低宿主中，畸形细胞中的hymenoptaecin表达急剧增加。这表明需要更高剂量的hymenoptaecin来对抗细菌感染，并且hymenoptaecin可能与宿主gloverin合作，在寄生宿主中建立针对病原体的防御线。基因组结构和系统发育分析进一步表明，重复事件发生在Cotesia分离后独立发生。重复的hymenoptaecin基因可能会增强抗菌肽的产生，帮助Cotesia蜂适应内寄生生活方式。

总之，我们研究了寄生过程中宿主-寄生蜂的免疫调控，重点关注AMPs。与对宿主黑化的持续抑制不同，我们发现寄生对AMP抑制的影响是暂时的，并且宿主AMP表达受到精细调控。此外，我们发现畸形细胞表达的hymenoptaecin具有抗菌活性，对于宿主在遭遇细菌感染时的存活至关重要。因此，我们推测来自宿主和寄生蜂畸形细胞的AMPs在宿主-寄生蜂系统中发挥着重要作用。我们的研究通过强调AMPs的重要性，为宿主-寄生蜂免疫相互作用提供了系统性的视角。