响应面法优化超声波辅助提取巴戟天木（Spatholobus littoralis Hassk.）酚类物质及抗氧化活性成分研究

本综述系统阐述了采用响应面法（RSM）结合Box-Behnken设计（BBD）优化超声波辅助提取（UAE）技术从巴戟天木（Bajakah Tampala）中高效提取总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）及抗氧化活性（AA）成分的研究，揭示了乙醇浓度、温度和时间的最优组合（54.19%, 64.38°C, 29.02 min），并通过LC-HRMS鉴定出scopoletin、cianidanol等5种关键抗氧化化合物，为绿色提取技术在传统药用植物开发中的应用提供了科学依据。

　　

引言

植物是生物活性化合物的重要来源，具有医疗相关特性，可用于多种医疗保健应用。巴戟天木（Bajakah Tampala，BT）（Spatholobus littoralis Hassk.）是印度尼西亚加里曼丹岛热带雨林的一种本土药用植物。当地部落Dayak认为巴戟天木的煎剂具有增强的治疗特性，包括抗癌症、肌肉疾病和腹泻的能力。尽管有传统应用，但对BT生物活性的研究仍需进一步科学调查，特别是测量生物活性化合物的类型、数量和谱分析。

超声波辅助提取（UAE）是一种环保方法，可提高植物中生物活性化合物的产量和质量。超声脉冲用于产生空化气泡，这些气泡迅速破裂，在特定区域积累热量和压力，从而破坏细胞膜并释放出一些分子。UAA在保持分离分子生物活性的同时提高了提取产量。例如，通过UAE制备的提取物的抗氧化活性优于使用传统方法提取的提取物，保持了对其治疗各种疾病至关重要的药用特性。减少暴露于剧烈提取条件的时间保护了敏感分子，否则这些分子会降解，从而保留了它们的药用潜力。UAE显著缩短了提取所需的时间和所用溶剂的量，同时仍确保高产量并保护被去除物质的生物活性。

温度通过影响生物活性化学物质的溶解度和超声空化的功效来改变提取过程。升高的温度可能会提高提取效率，但可能会损害敏感分子。在UAE中，通常在中等温度下进行，以优化效率并保持化合物稳定性。茎皮在高达60°C的温度下提取对总酚、黄酮和自由基清除活性产生了良好影响。然而，高于60°C的温度会增加Sterculia quadrifida R.Br中一些热不稳定的抗氧化化合物的降解。UAE的应用以及提取持续时间、温度和频率已证明能够优化生物活性化合物的产量，同时保持敏感植物化学物质的最佳提取条件。

使用食品级溶剂（例如水和乙醇）已显著增强了UAE从各种植物材料中提取多酚的能力。尽管对BT的兴趣日益浓厚，并且许多研究使用传统提取方法（例如用甲醇、乙醇或乙酸乙酯浸渍、回流和梯度溶剂提取以及基于索氏提取/浸渍的谱分析）探索其植物化学成分，但在绿色高效提取技术的应用方面仍然存在显著差距。具体来说，UAE尚未应用于BT，尽管对不同植物基质的研究反复证明其能够加速提取、提高热敏感酚类和黄酮的产量并减少溶剂使用。因此，迫切需要将UAE应用于BT，以系统优化提取参数并最大化其生物活性成分的回收率。

采用可再生、环保的工艺（例如UAE）可能会提高提取效率，并以更环保的方式从这种具有文化重要性但未充分利用的药用木材中生产有效且可重复的植物药物。对BT中生物活性化合物的谱分析研究较少。本研究旨在使用UAE和响应面方法结合Box-Behnken设计优化乙醇浓度、提取时间和温度，以最大化从BT中提取酚类、黄酮和抗氧化剂的产量。此外，采用LC-HRMS对BT提取物中存在的生物活性化合物进行了谱分析。

材料与方法

材料

巴戟天木（BT）（Spatholobus littoralis Hassk.）是主要材料资源。Spatholobus littoralis Hassk.木材源自印度尼西亚加里曼丹岛，由泗水大学药学院传统医学与发展信息中心鉴定和收集（1540/D.T/X/2023）。

乙醇（分析纯）购自Mallinckrodt Chemicals。Folin-Ciocalteu、碳酸钠（Na₂CO₃）、槲皮素、氯化铝（AlCl₃）、亚硝酸钠（NaNO₂）和DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）购自Sigma Aldrich。主要设备是UAE（Ultrasonic LW 600D, 50/60 Hz）和UV-Vis分光光度计（Shimadzu Europe – UV Mini-1240）。

BT的干燥程序

将尺寸为4 cm × 15 cm的BT木片在柜式干燥机（Maxindo）中于50°C下干燥四小时，以达到均匀的水分含量。然后将干燥的木材使用研磨机（Fomac）研磨成细粉，并通过40目筛。将所得粉末在室温下保存在密封塑料袋中用于进一步分析。

使用UAE提取BT

将两克BT粉末与40 mL不同浓度（50%至90%）的乙醇以1:20（w/v）的比例混合。将混合物置于封闭的锥形瓶中，并在超声波浴中进行UAE。根据RSM设计，在乙醇浓度50%至90%、温度50°C至70°C和超声持续时间10至40 min的不同条件下进行提取。提取后，将样品真空过滤以获得提取物溶液，并在-20°C下保存。

总酚含量（TPC）分析

将0.5 mL稀释20倍的提取物溶液与2.5 mL Folin-Ciocalteu试剂和2 mL 7.5% Na₂CO₃混合。将混合物在黑暗中于室温下孵育30 min。使用UV-Vis分光光度计在760 nm处测量吸光度。没食子酸用作校准曲线的参考，结果表示为每克BT的没食子酸当量毫克数（mg GAE/g）。

总黄酮含量（TFC）分析

将4 mL稀释10倍的提取物溶液与0.3 mL 5% NaNO₂混合并涡旋。孵育5 min后，加入0.3 mL 10% AlCl₃试剂并充分混合，然后孵育6 min。最后，加入2 mL 4% NaOH和2.4 mL去离子水并孵育15 min。在510 nm处测量吸光度。槲皮素用作参考，结果表示为每克BT的槲皮素当量毫克数（mg QE/g）。

抗氧化活性（AA）分析

将提取物溶液稀释20倍。将2 mL 0.2 mM DPPH甲醇溶液与2 mL稀释提取物混合，并在无光条件下于室温孵育30 min。空白通过混合2 mL 0.2 mM DPPH溶液和2 mL甲醇制备。使用UV-Vis分光光度计在517 nm处测量吸光度。抑制百分比按公式1计算。

Inhibition (%) = (Blank absorbance - Sample absorbance) / Blank Absorbance × 100% (1)

提取优化的实验设计

使用响应面方法（RSM）和Box-Behnken设计（BBD）进行提取参数的优化。自变量包括乙醇浓度（50%、70%和90%）、提取温度（50°C、60°C和70°C）和提取时间（10 min、25 min和40 min）。测量的响应包括TPC、TFC和AA。使用Design-Expert 13程序进行统计分析以确定最佳提取条件。通过在最佳条件下进行三次重复试验验证实验结果。

三个响应的实验数据使用二阶多项式模型绘制，公式如下（公式2）：

Y = β_o + ∑_i=1³ β_i X_i + ∑_i=1³ β_ii X_i² + ∑_j³ ∑_i=2³ β_ij X_i X_j (2)

Y表示BT提取物溶液的TPC、TFC和抗氧化活性（DPPH自由基清除）的响应。X_i和X_j代表UAE的自变量，即乙醇浓度（%）、提取温度（°C）和提取时间（min）。β_o表示截距的回归系数，β_i表示线性项，β_ii表示二次项，β_ij表示交互项。使用三维（3D）等高线图说明因变量与相应值之间的关系。

使用液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）分析化合物

在UAE最佳条件下获得的浓缩提取物使用液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）进行分析，以鉴定生物活性成分。研究揭示了酚类化合物、黄酮类化合物和其他有益物质的存在。

将乙醇提取物在温和的氮气流下蒸发以浓缩生物活性化合物。然后将浓缩的提取物稀释两倍至最终体积1500 μL，涡旋2 min，并在6000 rpm下离心2 min。将所得上清液通过0.22 μM注射器过滤器收集，并转移到自动进样器小瓶中，用于注入LC-HRMS系统。色谱分离在超高效液相色谱（UPLC）系统（Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLCnano）上进行，配备Hypersil GOLD aQ色谱柱（50 mm x 1 mm × 1.9 μM粒径），并在操作期间保持在30°C。流动相由0.1%甲酸水溶液（洗脱液A）和0.1%甲酸乙腈溶液（洗脱液B）组成，梯度程序如下：5%至60%在13 min内，60–95%在7 min内，在95%保持3 min，然后在0.1 min内返回5%并平衡4.9 min。整个运行过程中流速保持在40 μL/min。

使用Thermo Scientific Q Exactive质谱仪在正离子模式下进行质谱检测。数据在m/z范围100–1500内以全扫描模式获取，分辨率为70,000 FWHM（半高全宽），同时进行数据依赖的MS/MS碎裂，分辨率为17,500，以促进化合物鉴定。高分辨率设置（30,000–70,000 FWHM）确保了分析物范围内的精确质量测定。使用Compound Discoverer软件处理原始数据，并通过与mzCloud MS/MS库进行光谱匹配来鉴定化合物。

统计分析和模型验证

使用方差分析（ANOVA）结果确定提取过程的线性、二次和交互作用对观察到的响应（TPC、TFC和AA）的影响。响应的显著性以p < 0.05的显著性水平测量。使用一些统计参数评估开发的模型的充分性，包括确定系数（R²）、调整确定系数（调整R²）、变异系数（CV）、失拟、回归F值和回归p值。使用Design-Expert 13软件（Stat-Ease Inc., Minneapolis, U.S.A.）确定最佳提取条件。预测方程以简化形式表示，排除不显著的系数，仅保留显示统计显著性的项。通过比较最佳条件下的预测和实验结果（包括配对t检验）来验证模型。

结果与讨论

模型拟合

乙醇浓度、提取时间和提取温度的自变量及其范围基于BT的微波辅助提取（未发表数据）确定。TPC、TFC和AA的响应范围分别为11.38–18.61 mg GAE/g、3.58–7.18 mg QE/g和48.84–88.28%。响应值的多样性表明TPC、TFC的最大产量和自由基清除活性取决于UAE优化。

拟合模型的方差分析（ANOVA）结果显示，确定系数（R²）表明模型与所选变量之间具有强拟合性，TPC、TFC和AA的值分别为0.8852、0.9548和0.9460。这些值表明模型与数据拟合良好，意味着自变量有效预测响应变量。变异系数（CV）对于TPC、TFC和AA分别为6.85%、7.27%和6.14%。而失拟不显著（p > 0.05；TPC、TFC和AA分别为0.0864、0.2042、0.3296）。这些值表明对于所有测试模型，失拟不显著（p > 0.05），表明响应面模型在所选范围内提供了令人满意的拟合，并且因素的影响显著（p < 0.05）。高于4.0的精确度值通常表示可接受的信号噪声比，显示模型解释的变异显著大于随机误差，从而确认了结果的稳健性。在本研究中，TPC、TFC和AA的高精确度分别为8.3891、11.0758和11.2248，意味着模型提供了足够的信号。

自变量对BT提取物溶液TPC的影响

总酚含量范围从11.38 mg GAE/g到18.61 mg GAE/g。评估了各种提取参数对TPC的影响，结果表明最大TPC在70%乙醇浓度、60°C超声温度和25 min超声时间的实验条件下实现。ANOVA和回归分析的结果表明，建议的模型对于评估提取物溶液的TPC非常显著（p < 0.05）。乙醇浓度（p < 0.001）显著影响从BT中回收TPC，而超声温度和时间对TPC没有影响。所有自变量和二次变量之间的交互作用不显著。此外，TPC受到乙醇浓度的二次影响显著（p < 0.05），而温度和超声持续时间的影响不显著。因此，确定TPC受到乙醇浓度的显著影响。结果与Ghitescu等人的研究一致，该研究显示使用超声浴提取云杉树皮时，TPC响应的最关键因素是70%乙醇浓度。乙醇是一种极性质子溶剂，具有作为氢供体的羟基，特别有效地提取低分子量化合物，例如糖基化和非糖基化的酚类化合物。向乙醇中添加水通过软化植物细胞壁提高了TPC回收率，使扩散驱动的质量传递更有效。醇类溶剂比水更有效地提取酚类化合物，因为它们的分子结构允许通过C–O和O–H键进行更强的相互作用，而水仅通过O–H键相互作用，并且可用的氧电子对较少。

一些研究表明提取温度是一个重要因素，可以显著影响UAE中的提取产量。然而，本研究的结果是提取温度和时间的提取对TPC不显著。证明从BT中提取TPC有效性的预测方程使用显著项制定如下：

Y_TPC = -37.16 + 0.47 X₁ - 0.004 X₁² (3)

其中Y_TPC表示BT提取物溶液中的TPC（mg GAE/g），X₁和X₁²代表乙醇浓度。回归方程中的正系数表示直接关系，其中自变量（X）的增加导致因变量（Y）的增加。负二次项表明TPC随着乙醇浓度增加至最佳点，之后较高浓度导致TPC下降。溶剂浓度和温度的负二次效应在RSM研究中常见，并且在从植物基质（如酸樱桃）中提取多酚的研究中也有报道。

为了研究自变量对BT提取物TPC的影响，通过在实验数据范围内改变两个变量同时保持第三个变量恒定来生成3D表面图。图1a显示随着乙醇浓度从70%降低到50%，TPC显著增加，达到最大值。乙醇从80%增加到90%降低了TPC。因此，BT提取物的TPC产量作为乙醇浓度的函数增强。图1b显示温度从50°C增加到70°C增加了TPC；然而，温度和提取时间对TPC没有显著影响。图1c显示TPC随着提取温度和时间的增加而增加，直至最佳60–65°C和24–40 min，之后下降；然而，温度和时间的交互作用不显著。

总黄酮含量（TFC）

TFC范围从3.58 mg QE/g到7.18 mg QE/g。结果表明最大TFC在70%乙醇浓度、60°C超声温度和25 min超声时间的实验条件下实现。ANOVA和回归分析的结果表明，建议的模型对于评估提取物溶液的TFC非常显著（p < 0.001）。乙醇浓度（p < 0.0001）和温度（0.05）显著影响从BT中回收TFC，而时间对TFC没有影响。所有自变量之间的交互作用不显著。此外，TPC受到乙醇浓度的二次影响显著（p < 0.0001），超声温度（p < 0.01）和超声时间（p < 0.01）的二次影响统计显著。因此，确定TFC受到乙醇浓度和温度的显著影响。提取温度是UAE中的一个关键因素，较高的温度通常通过促进键破坏、增加溶解度以及加速扩散和质量传递来提高产量。证明从BT中提取TPC有效性的预测方程使用显著项制定如下：

Y_TFC = -36.92 + 0.36 X₁ + 0.98 X₂ - 0.003 X₁² - 0.008 X₂² - 0.004 X₃² (4)

其中Y_TFC表示BT中的TPC（mg GAE/g），X₁、X₂和X₃分别代表乙醇浓度、温度和时间超声。

为了确定TFC与变量实验数据之间的关系，以及测试变量之间的交互作用，呈现了3D响应表面图（图2）。乙醇浓度和超声温度对TFC的影响显示在图2a中。TFC随着乙醇浓度从70%降低到50%而增加，但在80%至90%的浓度之间降低。高于70%的乙醇溶解黄酮的效果较差，而50%至60%的乙醇，具有与黄酮相似的极性，提高了溶解度。乙醇浓度影响溶剂极性和黄酮溶解度。图2b显示了在恒定温度下乙醇浓度和超声时间对TFC的影响。TFC随着提取温度在60°C至70°C之间增加，在约60°C达到峰值。较高的温度通过增加溶剂扩散来增强提取，但高于最佳范围的温度可能导致降解。温度也影响空化，使气泡在沸点附近更容易形成，尽管它们的爆炸能力在较高温度下降低。当乙醇浓度在50–70%范围内且提取时间为25–30 min时，TFC达到最高总黄酮值。使用UAE从Flos Sophorae Immaturus（FSI）中提取黄酮化合物的最佳条件是在70%乙醇浓度、61°C提取温度和30 min提取时间下进行。在图2b中，TFC在25 min时达到最大值，然后在34至40 min之间降低。随着材料暴露于溶剂的时间延长，提取的生物活性化合物增加，导致产量持续上升直至达到饱和。然而，过长的提取时间可能导致黄酮降解。图2c显示二次曲线的形状显示TFC在提取温度60–65°C和22–34 min内增加，直至达到最佳点。然后，随着提取温度和时间的增加，TFC降低。然而，基于ANOVA结果，提取温度和提取时间之间交互作用的图没有显著影响。超过最佳限度的温度和时间会降解黄酮。温度和乙醇浓度是从Radix Astragali中提取黄酮的主要参数。

抗氧化活性（AA）

评估了各种提取参数对DPPH自由基清除活性的影响。AA范围从48.83%到88.27%，最大活性在50%乙醇、70°C提取温度和25 min超声条件下观察到。ANOVA和回归分析的结果表明，指定模型对于评估BT提取物溶液的AA显著（p < 0.01）。乙醇浓度（p < 0.001）和温度（p < 0.01）显著影响从BT提取物溶液中回收AA化合物，而超声时间对AA没有显著影响。

所有变量之间的交互作用不影响BT提取物溶液的AA。此外，乙醇浓度的二次影响（X₁²）（p < 0.01）和超声时间（X₃²）显著（p < 0.01）影响AA，而温度（X₂²）的二次影响不显著。因此，超声温度和乙醇浓度是对BT提取物溶液AA有显著影响的显著变量。使用显著项对BT提取物溶液AA的预测方程可以制定如下：

Y_AA = -225.38 + 2.55 X₁ + 6.08 X₂ - 0.018 X₁² - 0.033 X₃² (5)

其中Y_AA表示BT提取物溶液中的AA（%），X₁、X₂和X₃分别代表乙醇浓度、温度和超声时间。乙醇浓度和提取温度具有积极影响；因此，乙醇浓度和提取温度的增加增加了AA的响应。增加乙醇浓度增强了溶剂和材料之间的接触，从而提高了扩散速率。然而，使用过量的乙醇浓度可能抑制超声波能量传递，因为溶剂在能量到达材料基质之前吸收能量，因此提取的化合物水平降低。溶剂的物理性质，包括粘度和密度，可以通过高浓度的乙醇改变，这可能干扰超声能量的传输。随着溶剂粘度响应乙醇浓度的增加，空化气泡的形成和分解可能减少。这由二次乙醇浓度因子（X₁²）证明，它对回归方程产生负面影响。提取温度的增加导致提取的生物活性化合物量增加。在高于最佳温度的某些温度下，酚类和黄酮类化合物可能经历热降解和聚合，因此必须在UAE过程中始终监控提取温度。

为了确定AA与变量实验数据之间的关系，以及测试变量之间的交互作用，呈现了3D响应表面图（图3）。在图3a中，AA在乙醇浓度从65%到50%时增加，但在80%到90%时降低。50%至60%的乙醇极性具有良好的溶解度和BT中生物活性化合物的提取效率。乙醇浓度越高，材料和溶剂之间的接触面积越大，因此溶剂扩散速率越高。在图3b中，当乙醇浓度在50–70%范围内且提取时间为22–35 min时，AA达到最高值。延长的提取时间有助于生物活性化合物从植物组织释放到溶剂中；然而，过长的持续时间可能由于渗透压不平衡或目标化合物的降解而降低效率。在图3b中，AA从15 min的提取时间增加到AA的最佳区域22–35 min，然后降低到提取时间的上限40 min。在图3c中，增加温度