不同碳水化合物水平再投喂通过表观遗传调控影响尼罗罗非鱼幼鱼和成鱼代谢适应性的机制研究

本研究发现短期再投喂不同碳水化合物（CHO）与蛋白质比例饮食可显著调控尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝脏和肌肉中的DNA全局（去）甲基化（5-mC、5-hmdC、5-cadC等）及组蛋白修饰（H3K9ac、H3K36me3等），并影响表观调控因子（dnmt、tet、setd1b、sirt等）表达。高碳水化合物/低蛋白（HC/LP）饮食诱导肌肉DNA低甲基化和组蛋白低乙酰化/低甲基化，且响应存在发育阶段特异性，为水产饲料精准调控与代谢健康管理提供新视角。

　　

引言

表观遗传学关注环境与行为因素如何在不改变DNA序列的前提下调控基因活性。营养状态作为关键环境因素，可通过DNA甲基化/去甲基化、组蛋白修饰等机制调节动物代谢过程。已有研究表明，在哺乳动物和小鼠中，营养状态变化可影响DNA甲基化转移酶（DNMTs）和Ten-eleven translocation（TET）酶家族的表达，进而重塑表观遗传景观。在鱼类中，彩虹鳟等肉食性鱼类对碳水化合物利用能力较差，其肝脏表观遗传重塑与葡萄糖不耐受表型相关；而尼罗罗非鱼作为杂食性鱼类，能够高效利用膳食碳水化合物作为主要能量来源。尽管其生理和转录层面的代谢适应性已有较多研究，但其表观遗传调控机制尚不明确。

材料与方法

实验设计与饲料

实验样本来自先前已发表的研究。实验采用随机设计，设6个重复水箱。尼罗罗非鱼幼鱼（50-60克）和成鱼（450-550克）在4平方米水泥池中养殖，水流持续通气。实验前进行14天适应期，投喂商业饲料（36%粗蛋白+4%粗脂肪）。随后进行4天禁食，再分别投喂高碳水化合物/低蛋白（HC/LP，639.2克/千克饲料碳水化合物，164.9克/千克饲料蛋白质）或低碳水化合物/高蛋白（LC/HP，47.4克/千克饲料碳水化合物，607.9克/千克饲料蛋白质）饲料4天。水温、溶解氧和pH值等环境参数全程监控。

样品采集与处理

在禁食4天后及再投喂4天后分别取样。取肝脏和肌肉组织，液氮速冻后存于-80°C，用于后续DNA甲基化、组蛋白修饰及基因表达分析。

RNA提取与实时荧光定量PCR

使用TRIzol法提取组织总RNA，通过NanoDrop测定浓度并验证完整性。设计引物扩增与表观遗传调控相关的基因，包括DNA甲基化相关基因（dnmt1、dnmt3aa、dnmt3ba、dnmt3bb、tet1、tet2、tet3）、组蛋白甲基化相关基因（如setd1b、kmt2、suv39h1b、kdm4）和组蛋白乙酰化相关基因（如kat2a、sirt2、sirt5）。以ef1α作为内参基因，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测mRNA表达水平。

全局DNA甲基化及氧化衍生物分析

通过抗氧化剂保护的DNA提取方法获取DNA，使用DNA Degradase Plus?酶解DNA为单核苷。采用高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）分析5-甲基-2′-脱氧胞苷（5-mdC）、5-羟甲基-2′-脱氧胞苷（5-hmdC）、5-甲酰基-2′-脱氧胞苷（5-fdC）、5-羧基-2′-脱氧胞苷（5-cadC）及2′-脱氧胞苷（dC）的含量，计算各衍生物占总胞苷的比例。

全局组蛋白修饰分析

组织经Triton提取缓冲液和酸提取法提取组蛋白蛋白，通过Western blotting检测组蛋白修饰水平，使用抗体包括H3K4me3、H3K9me3、H3K36me3、H3K9ac及总H3。

统计分析

数据采用SPSS 22软件处理，符合正态分布的数据使用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验；非参数数据采用Kruskal-Wallis检验。显著性水平设为p < 0.05。

结果

再投喂不同碳水化合物饮食对尼罗罗非鱼全局DNA甲基化景观的影响

短期再投喂显著影响了尼罗罗非鱼幼鱼和成鱼肝脏与肌肉中的DNA甲基化及其氧化衍生物水平。在幼鱼肝脏中，再投喂使5-hmdC含量降低，但5-mdC、5-fdC、5-cadC和dC无显著变化。在幼鱼肌肉中，HC/LP饮食组5-fdC含量升高。成鱼肝脏中，再投喂后5-hmdC降低，HC/LP组5-cadC也降低；而成鱼肌肉中，HC/LP饮食引起5-mdC降低和dC升高，提示DNA低甲基化状态。

再投喂对DNA甲基化调控因子表达的影响

在幼鱼肝脏中，再投喂后dnmt3bb表达上升，HC/LP组中dnmt1、dnmt3aa、dnmt3ba表达也升高；tet1和tet2表达在再投喂后下降。在成鱼肝脏，LC/HP组dnmt1和dnmt3aa表达降低，而HC/LP组dnmt3ba和dnmt3bb表达上升；tet3在再投喂后下降，tet1和tet2在LC/HP组中表达降低。在肌肉组织中，基因响应模式因发育阶段和饮食组成异质，但HC/LP饮食普遍与tet家族基因上调及dnmt部分基因变化相关。

再投喂对全局组蛋白修饰的影响

组蛋白修饰对再投喂饮食组成响应显著。幼鱼肝脏中，LC/HP组H3K9ac升高，而HC/LP组导致H3K36me3和H3K9ac降低。幼鱼肌肉中，HC/LP组H3K36me3升高。成鱼肝脏组蛋白修饰无显著变化，而成鱼肌肉中LC/HP组诱导H3K9me3和H3K9ac升高，HC/LP组则与这些标记的低修饰状态相关。

再投喂对组蛋白修饰调控因子表达的影响

组蛋白修饰相关酶基因表达响应复杂且组织特异性明显。在幼鱼肝脏中，再投喂后setd1ba、kmt2a、kmt2ba、kmt2bb及kat6a等表达降低，而suv39h1b、kdm4ab、kdm4c、kat2a、gtf3c4表达上升；HC/LP组还引起kdm4b、kdm4c、sirt5等高表达。在成鱼肝脏与肌肉中，多数组蛋白修饰酶基因响应再投喂而表达下调，但HC/LP饮食往往与kdm4、sirt2、sirt5等 eraser 基因的上调相关，提示其可能通过去甲基化/去乙酰化作用促进低修饰状态。

讨论

再投喂不同碳水化合物饮食调控尼罗罗非鱼DNA甲基化景观及修饰酶表达

本研究表明，短期再投喂不同CHO/蛋白比例饲料可影响尼罗罗非鱼全局DNA甲基化及其氧化衍生物水平，其中再投喂普遍降低肝脏5-hmdC含量，而成鱼肌肉中HC/LP饮食诱导DNA低甲基化。这一现象与TET酶介导的主动去甲基化过程一致，且与tet基因表达上调相符。与彩虹鳟等物种相比，尼罗罗非鱼表现出物种特异性及发育阶段特异性的表观遗传响应模式，可能与其高效利用碳水代谢适应性有关。

再投喂调控组蛋白修饰及相关酶表达

组蛋白修饰对饮食改变的敏感性在此次实验中得到进一步验证。HC/LP饮食与幼鱼肝脏中H3K9ac和H3K36me3降低、成鱼肌肉中H3K9me3和H3K9ac降低相关，且这些变化与kdm4、sirt等 eraser 酶基因表达上调一致，表明其可能通过去乙酰化/去甲基化作用调节染色质结构，影响基因表达。与彩虹鳟等研究对比，尼罗罗非鱼响应模式再次凸显物种间代谢策略差异。

结论

本研究系统揭示了短期禁食后再投喂不同碳水化合物/蛋白比例饲料对尼罗罗非鱼幼鱼和成鱼DNA甲基化、组蛋白修饰及表观遗传调控因子表达的影响。高碳水化合物饮食倾向于诱导肌肉DNA低甲基化及组蛋白低修饰状态，且这些响应具有发育阶段特异性。该研究为理解鱼类营养编程、代谢适应性及精准水产饲料开发提供了重要理论依据。