效价与亲合力决定抗TNFR2纳米抗体融合蛋白激动活性的机制研究

《Cell Chemical Biology》：Valence and avidity determine the agonistic activity of anti-TNFR2 nanobody fusion proteins

本刊推荐：TNFR2激动剂在自身免疫疾病治疗中潜力巨大，但传统TNF和抗体衍生激动剂存在稳定性差、活性低等问题。Anany等通过构建系列不同效价的TNFR2特异性纳米抗体融合蛋白，发现六价及以上构型可实现低皮摩尔级高效激动，且稳定性显著提升，为TNF超家族受体激动剂开发提供了新范式。

　　

在免疫治疗领域，肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）近年来备受关注。与广泛表达、主要介导炎症反应的TNFR1不同，TNFR2的表达更具选择性，尤其在调节性T细胞（Tregs）和部分髓系细胞上富集，能够激活经典的NF-κB通路以及更为独特的替代性NF-κB通路，从而发挥强大的抗炎和免疫调节作用。这使得TNFR2激动剂成为治疗自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、炎症性肠病等）的潜力新星。然而，TNFR2激动剂的研发之路却充满挑战。传统的策略主要基于其天然配体——肿瘤坏死因子（TNF）或常规抗体进行改造。TNF本身是一个三聚体，能同时结合三个TNFR2分子，但其可溶形式（sTNF）对TNFR2的激活能力很弱，只有膜结合形式（memTNF）或在细胞接触环境下才能有效激活。基于TNF开发的激动剂常常面临稳定性不佳、难以规模化生产、难以实现TNFR2特异性（即避免同时激活TNFR1）以及对寡聚化状态要求苛刻等问题。而基于常规抗体的TNFR2激动剂，其活性往往依赖于其Fc段与Fcγ受体（FcγR）的结合（即需要辅助细胞进行交叉连接），这引入了不必要的复杂性；一些具有内在激动活性的抗体则存在特异性活性低、易聚集、稳定性差等缺点。因此，开发具有高活性、高稳定性、生产简便且不依赖FcγR的TNFR2激动剂成为该领域亟待突破的瓶颈。

在此背景下，由Harald Wajant团队领导的研究小组在《Cell Chemical Biology》上发表了一项重要研究。他们另辟蹊径，将目光投向了纳米抗体（Nb）。纳米抗体是来源于骆驼科动物体内仅由重链可变区（VHH）构成的小分子抗体片段，具有分子量小、稳定性高、易于进行基因工程改造和表达等优点。研究人员猜想，能否利用纳米抗体作为“乐高积木”，通过构建不同效价（即结合价，指一个分子能结合受体的数量）的融合蛋白，来创造出高效且稳定的TNFR2激动剂？其核心科学问题是：效价和亲合力（由多价结合带来的表观亲和力增强）如何共同决定TNFR2激动剂的活性？

为了回答这些问题，研究人员开展了一项系统性的工程学研究。他们首先通过噬菌体展示技术筛选获得了14个靶向人TNFR2的纳米抗体序列，并从中挑选了6个具有代表性的纳米抗体（如Nb:188）进行深入表征。随后，他们进行了一系列精巧的分子设计，将这些纳米抗体与不同的蛋白质支架（如IgG1的Fc段、Tenascin-C的三聚化结构域等）进行融合，构建了一个包含超过20种不同构型的融合蛋白库。这些构型涵盖了从二价到十二价的不同效价水平，旨在全面探索效价与活性的关系。研究团队利用HEK293细胞瞬时转染系统高效表达了这些融合蛋白，并采用多种细胞模型（如HT1080-Bcl2-TNFR2报告基因细胞、HeLa-TNFR2-TNFR1KO细胞等）来评估其激活TNFR2下游信号通路（如经典NF-κB通路，通过IL-8分泌量检测；替代性NF-κB通路，通过p100蛋白向p52的加工过程来评估）的能力。同时，他们通过结合实验分析了这些融合蛋白与TNFR2的亲和力，并通过凝胶过滤色谱等技术评估了蛋白质的聚集状态和稳定性。最后，他们还在一项关键的功能性实验中，验证了最优候选分子在体外扩增和激活人原代调节性T细胞（Tregs）的能力，这部分实验所使用的PBMC（外周血单核细胞）来源于德国维尔茨堡大学医院的白细胞分离术产品。

本研究主要的关键技术方法包括：噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体；分子克隆技术构建系列不同效价的纳米抗体融合蛋白表达载体；利用哺乳动物细胞（HEK293）表达系统进行重组蛋白生产；通过ELISA、Western Blot、流式细胞术等技术系统评估蛋白质的激动活性、信号通路激活情况及对原代免疫细胞功能的影响。

初始表征TNFR2特异性纳米抗体

研究人员首先证实了筛选到的6个TNFR2特异性纳米抗体（如Nb:188）均能以高亲和力结合人TNFR2，其中部分还能交叉结合食蟹猴或小鼠的TNFR2，但不结合TNFR1。当将这些纳米抗体构建成二价的Fc融合蛋白（Nb-Fc-GpL）时，它们本身几乎不激活TNFR2。然而，在与表达FcγRIA的细胞共培养时，这些二价纳米抗体融合蛋白表现出强烈的TNFR2激动活性。这表明，类似于常规抗体，通过FcγR介导的寡集化可以将非激动性的TNFR2结合分子转化为有效的激动剂。

多价TNFR2特异性Nb融合蛋白是有效的真正TNFR2激动剂

这是本研究的核心发现。研究人员系统地测试了不同效价的Nb:188融合蛋白的活性。结果发现，激动活性强烈依赖于效价：二价和三价构型活性很低（EC₅₀> 100 ng/mL）；四价和五价构型显示出中等活性；而一旦效价达到六价或更高，所有测试的构型（无论纳米抗体域是位于分子N端还是两端）都表现出极其强大的激动活性，其半数有效浓度（EC₅₀）低至皮摩尔级别（1-10 ng/mL），其最大激活效果与高效的TNF基准激动剂STAR2相当。进一步研究表明，效价的增加不仅显著提高了分子对TNFR2的表观亲和力（亲合力效应），更重要的是，它促进了TNFR2在细胞表面的有效簇集，这是激活下游信号的关键。研究人员还排除了蛋白质聚集是导致高活性的原因，因为纯化后的高活性蛋白在凝胶过滤分析中主要以预期大小的单体形式存在。

纳米抗体与配体基TNFR2激动剂活性相当

为了评估其开发潜力，研究人员将最优的六价、九价和十二价纳米抗体融合蛋白（如3xNb:188-Fc）与相应效价的、经过工程化改造的TNF突变体（scTNF80，特异性靶向TNFR2）激动剂进行了头对头比较。结果显示，纳米抗体基的激动剂在激活经典NF-κB通路（诱导IL-8分泌）和替代性NF-κB通路（诱导p100加工为p52）方面，其效力与TNF基的激动剂相当，甚至更优。此外，它们也能有效诱导TNFR2信号复合物的组装，招募TRAF2、cIAP1等关键信号分子。

3xNb:188-Fc(L234F/L235E/P331S)有效促进Treg扩增

作为临床转化的初步探索，研究人员对活性最好的六价构型3xNb:188-Fc进行了优化，缩短了连接肽长度并引入了Fc段突变（L234F/L235E/P331S）以进一步减少FcγR结合。优化后的分子（3xNb:188(G4S)₁-Fc(FES)）保持了高活性和良好的稳定性。在功能验证中，该分子能在体外培养的人PBMC中有效扩增Tregs（约1.4倍），并上调Tregs表面的激活标志物（如CD25, 4-1BB, GITR, TIGIT, ICAM-1），这与TNFR2激动剂的预期免疫调节功能完全一致。

归纳研究结论和讨论部分，本研究的重要意义在于：首先，它明确揭示了“效价”是驱动TNFR2激动剂活性的一个普适性关键决定因素。当效价达到六价或以上时，无论其结合域是复杂的（如TNF三聚体、抗体的VH/VL区）还是简单的（如单个纳米抗体域），都能有效地簇集足够数量的TNFR2（理论上是六个或以上），从而触发强大的下游信号。这为理解TNF受体超家族（TNFRSF）的激活机制提供了重要见解，并可能为开发靶向该家族其他受体的激动剂提供蓝图。其次，本研究成功地将这一设计原则应用于纳米抗体，创造出了一类新型的TNFR2激动剂。与TNF或常规抗体衍生的激动剂相比，纳米抗体基激动剂展现出卓越的综合性能：极高的特异性活性（低皮摩尔级EC₅₀）、良好的表达产量、低聚集倾向和高稳定性。这些特性使其在临床开发中具有显著优势。最后，优化后的六价纳米抗体-Fc融合蛋白在体外展示了强大的Treg扩增和激活能力，为其在自身免疫性疾病治疗中的应用前景提供了坚实的临床前证据。尽管本研究还存在一些局限性（如未详细研究其“顺式”结合能力、未进行体内抗原性和药代动力学评估），但它无疑为下一代TNFR2靶向治疗药物的设计树立了新的标杆。