基于甲基转移酶标记与富集的全基因组非修饰DNA分析技术Active-Seq的开发与应用

为解决传统DNA甲基化检测技术对未甲基化CpG位点富集能力不足、测序深度要求高以及无法在低输入量（如cfDNA）条件下实现全基因组表观遗传分析的问题，研究人员开发了一种名为Active-Seq（azide click tagging for in vitro epigenomic sequencing）的新方法。该方法利用突变甲基转移酶M.Mpel和合成辅因子类似物特异性标记未甲基化CpG位点，并通过点击化学富集目标DNA片段，实现了仅需1 ng输入DNA和7000万测序读长即可完成全基因组未甲基化区域的高效分析。研究证实Active-Seq在细胞系、组织样本和液体活检中均能稳定捕获细胞类型特异性增强子和癌症相关低甲基化区域，为肿瘤早期检测和组织溯源提供了突破性技术平台。

　　

在表观遗传学研究领域，DNA甲基化作为关键调控机制一直备受关注。传统技术如全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）虽能精确检测甲基化位点，却存在DNA损伤严重、测序深度要求极高（通常需30X以上覆盖度）以及GC偏好性等问题。更值得注意的是，现有方法主要聚焦于甲基化位点的检测，而对未甲基化区域——这些区域恰恰是细胞身份标识和癌症早期诊断的关键——缺乏高效富集手段。特别是在液体活检场景中，细胞游离DNA（cfDNA）量少且片段化严重，传统技术难以实现全基因组层面的未甲基化区域分析。

针对这一挑战，Tosti等人开发了名为Active-Seq（azide click tagging for in vitro epigenomic sequencing）的革命性技术。该方法利用改造的细菌甲基转移酶M.Mpel与合成辅因子类似物，特异性在未甲基化CpG位点上引入叠氮标签，随后通过点击化学连接生物素进行亲和富集。这种酶促反应不仅避免了DNA损伤，还保留了原始序列信息和片段化特征（如末端motif），为多组学整合分析提供了可能。研究团队在《Cell Reports Methods》发表了这项成果，展示了从1 ng超低输入DNA中成功捕获全基因组未甲基化区域的能力。

关键技术方法包括：1）使用M.Mpel甲基转移酶与合成辅因子在未甲基化CpG位点进行酶促标记；2）单管式工作流整合末端修复、接头连接与点击化学富集步骤；3） streptavidin磁珠富集标记片段；4） Illumina平台测序与生物信息学分析（包括BWA-MEM2比对、DESeq2差异分析、deepTools信号可视化）；5）验证样本涵盖细胞系（NA12878、HEK293等）、结直肠癌患者组织（7例肿瘤/癌旁配对）和血浆cfDNA（5例癌症患者+5例健康对照）。

方法验证与性能表征

通过合成寡核苷酸 spike-in 实验证实，Active-Seq 对含4个未甲基化CpG的片段富集效率达100倍以上，而完全甲基化片段和非靶向片段背景信号低于1%。CpG密度梯度实验（1-10个位点/150bp）显示富集效率与位点数量正相关，且在24 ng背景DNA中仍可特异性回收1.3 pg目标DNA。与WGBS对比显示，Active-Seq在孤立未甲基化CpG位点（β=0）富集倍数达160倍，且信号与甲基化水平呈明显负相关。

与现有技术的比较优势

相较于MeDIP-seq对高甲基化区域的偏好性和WGBS的高冗余测序需求（>750M reads），Active-Seq仅需70M reads即可达到90%信号饱和，重复序列率（10-15%）显著低于WGBS（30-40%）。在功能区域分析中，Active-Seq显著富集于活性染色质标记区域（H3K4me3启动子、H3K27ac/H3K4me1增强子），而MeDIP-seq则更多覆盖基因体甲基化区域。

细胞类型特异性标记捕获

基于Loyfer等人构建的健康细胞甲基化图谱，Active-Seq在六种正常组织中成功检测到细胞类型特异性未甲基化标记区域（如血液粒细胞、乳腺管上皮细胞、结肠上皮细胞等），证实其在不同组织来源的混合样本中仍能准确识别组织溯源信号。

肿瘤样本中的差异甲基化区域分析

在7例结直肠癌患者的肿瘤/癌旁组织对比中，共鉴定出47,420个超甲基化区域和28,080个低甲基化区域。超甲基化区域显著富集于启动子区（与Polycomb抑制复合物PRC2靶标重叠），而低甲基化区域多位于基因间区和内含子区，与部分甲基化域（PMD）和H3K9me3修饰区域相关。LOLA分析显示超甲基化区域与EZH2、SUZ12（PRC2组分）及KDM4A转录因子结合位点重叠。

液体活检应用验证

通过肿瘤组织鉴定的DMRs筛选出4,300个在cfDNA中呈现显著信号差异的区域（|log2FC|>1.5）。在10例血浆样本（5例CRC患者+5例健康对照）中，低甲基化DMRs信号能清晰区分癌症与健康人群，而超甲基化DMRs则呈现较高个体异质性。示例区域显示癌症患者cfDNA在低甲基化DMRs中信号增强，而在超甲基化DMRs中信号减弱。

研究结论表明，Active-Seq首次实现了对全基因组未甲基化区域的高效、低输入富集，填补了现有表观遗传技术在该领域的空白。其优势在于：1）直接靶向具有生物学活性的未甲基化调控区域（增强子、启动子）；2）兼容超低输入量（1 ng），适用于液体活检场景；3）保留DNA原始序列与片段化信息，支持多组学整合分析；4）提供细胞类型解卷积能力，为癌症早期诊断和组织溯源提供新范式。未来通过优化单CpG位点分辨率计算模型和扩大临床验证队列，该技术有望成为癌症表观遗传检测的核心平台。