河西走廊三个流域中祁连裸鲤的空间食性分化与营养变异研究

本研究结合稳定同位素分析(SIA)和DNA宏条形码技术(metabarcoding)，系统揭示了青藏高原东北部河西走廊三大流域（石羊河、黑河、疏勒河）特有鱼类祁连裸鲤(Gymnocypris chilianensis)的食性组成与营养变异。结果显示δ13C和δ15N值存在显著空间差异，发现95个植物属和40个动物属，植物源性饮食呈现明显地理结构。研究表明流域水管理及人为干扰通过影响食物资源可用性塑造淡水食物网，为高寒河流生态系统保护提供科学依据。

　　

摘要

祁连裸鲤(Gymnocypris chilianensis)是分布于青藏高原东北部河西走廊三大流域——石羊河、黑河和疏勒河的特有鲤科鱼类。理解其食性生态对能量流动、生态位分化、环境变化适应响应及淡水生物多样性管理至关重要。研究采用稳定同位素分析与肠道内容物宏条形码的双重方法，揭示了祁连裸鲤的食性组成和营养变异。稳定同位素结果显示δ¹³C和δ¹⁵N值存在显著空间差异（多元方差分析，p < 0.05），表明流域特异的营养分化和碳源利用变异。宏条形码在所有样本中鉴定出95个植物属和40个动物属，包括共享和流域特异性类群。植物源性饮食模式呈现清晰的地理结构和强生态连贯性，可能反映了流域间水资源管理和人为干扰的差异。本研究为理解祁连裸鲤的营养生态提供了整合视角，并强调了区域环境背景在塑造淡水食物网中的作用，对高寒河流生态系统的保护管理具有启示意义。

引言

食性组成理解是生态学研究的基础，它揭示了物种的营养相互作用、资源利用和生态位分化。传统上，鱼类食性通过胃内容物形态学分析进行研究，但该方法受限于部分消化、难以区分的食糜和小型猎物，阻碍物种水平鉴定。为解决这些限制，分子和同位素技术日益整合到食性研究中。

稳定同位素分析提供时间整合的营养位置和碳源利用视角，同位素比率反映数周至数月的同化营养而非短期饮食事件。δ¹³C值追踪基础碳源差异，对区分食物网内能量路径至关重要，这些基础源包括本地生产（如浮游植物、附生藻类和大型植物）和陆源输入（如C₃或C₄植物）。δ¹⁵N值通过反映食物链传递中的逐步富集指示营养级变化。然而，稳定同位素无法解析饮食的分类组成，特别是对于杂食性或广食性消费者。

DNA宏条形码通过从肠道或粪便材料中进行分类单元特异性鉴定提供互补分辨率。靶向标准化基因标记如线粒体细胞色素c氧化酶I（COI，用于动物）和叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基（rbcL，用于植物），宏条形码可检测形态学无法识别或环境来源的饮食成分。COI因其高种间变异性和广泛参考库而被广泛用作动物的通用DNA条形码，而rbcL作为核心植物条形码基因，提供广泛的分类覆盖和跨多样藻类和维管植物谱系的可靠扩增。其提供的分类分辨率可从科或属到种水平，取决于参考数据库的可用性和完整性以及分类单元间的遗传分化程度。它已广泛应用于食性研究、生物多样性监测和群落生态学。然而，定量准确性受PCR偏倚和拷贝数变异限制，使其在估计饮食比例时可靠性较低。这些考虑强调了将宏条形码与稳定同位素分析等互补方法整合的重要性。

祁连裸鲤是一种特有的裂腹鱼物种，栖息于中国西北河西走廊的石羊河、黑河和疏勒河。这些内陆河流系统发源于祁连山，共同依赖冰川和雪融水补给，为干旱景观中的绿洲和生物多样性提供关键水资源。尽管有这些相似性，三条河流在水文管理和生态设置上显著不同。对祁连裸鲤而言，影响食性生态的重要环境变量包括水文稳定性、水质和基础食物资源多样性，这些强烈受水资源利用强度和河岸植被结构影响。在这些河流中，石羊河因农业提取高度开发，下游流量减少且植被简化；黑河受益于生态配水政策维持河岸湿地；疏勒河代表一个较小流域，具有中等干扰和混合植被条件。这些 contrasting 流域条件可能影响有机质输入和初级生产的可用性，从而影响祁连裸鲤的营养资源利用。作为本地物种，祁连裸鲤在维持高寒河流食物网中扮演重要生态角色，并作为淡水生态系统完整性的潜在指示物种，同时也代表有价值的当地渔业资源。

先前研究表明裂腹鱼通常为杂食性，具有高度可塑性饮食，适应环境条件和可用食物资源。在不同河流系统的祁连裸鲤种群中也观察到形态变异，表明对多样生境的局部适应。例如，一项系统地理学研究揭示了石羊河、黑河和黑河种群间的显著遗传分化，并伴随形态性状的地理渐变。此外，像许多其他鱼类一样，祁连裸鲤可能随着个体生长经历个体发育食性转变，通过在不同生活阶段利用不同食物项目减少种内竞争。然而，尽管其生态和经济重要性，对祁连裸鲤饮食和生态位的全面理解——特别是饮食变异如何与 contrasting 流域制度相关——仍然缺乏。

在本研究中，我们应用结合稳定同位素分析和DNA宏条形码的双重方法，调查了祁连裸鲤在三个不同河流盆地的饮食组成和营养变异。具体而言，我们旨在：（1）表征饮食成分（植物和动物）的空间模式，和（2）评估饮食变异是否与流域水平环境差异相关。通过整合分子和同位素数据，我们的发现为这种高寒鱼类的营养生态和适应策略提供了新见解，对高原地区淡水生物多样性保护具有启示意义。

材料与方法

材料来源

本研究使用的样本于2023年7月通过地笼网（总长4.6米）从河西走廊三个河流系统收集：石羊河（站点A：1927米，B：2243米，C：2844米）、黑河（站点D：2409米，E：1655米，J：2881米）和疏勒河（站点F：1772米，G：1424米，H：2010米）。采样过程通常涉及在第一晚布网并于次日早晨收回。这九个采样点选择覆盖每个河流系统内祁连裸鲤的主要分布范围。七月采样策略性选择，因其代表祁连裸鲤产卵后摄食高峰，此时胃饱满度和猎物多样性通常最高，由于春季雪融后稳定的水温和丰富的无脊椎动物/藻类资源。类似对冷水高原鱼类的研究已成功使用夏季采样捕捉代表性摄食生态。用于宏条形码摄食分析的84条祁连裸鲤个体选择具有高胃饱满度。胃饱满度使用0-5视觉饱满度指数评估，基于相对饱满度方法的简化实施。该指数对应胃体积被食物占据的大致比例：0=空，1=1-25%满，2=26-50%满，3=51-75%满，4=76-99%满，5=完全充满。选择饱满度指数≥3的个体，表示中度至完全充满的胃，用于基于宏条形码的饮食分析。这种标准化方法确保观察者间一致性并允许可重复选择具有足够饮食材料的标本。这些个体均为幼鱼，标准长度范围如下：石羊河（79.74-156.23毫米）、黑河（61.41-145.09毫米）和疏勒河（47.09-102.53毫米）。未确定个体标本性别，样本包含混合雄性和雌性个体，所有在七月采样期间均未性成熟。该样本量通过稀疏分析确认充足，显示猎物操作分类单元（OTU，代表 distinct 猎物分类单元）在此采样努力下饱和。用于饮食分析，胃小心解剖并保存在95%乙醇中用于后续分子分析。肌肉组织样本使用无菌手术刀从每条鱼背部区域收集。皮肤用乙醇擦拭，并从单个个体的背部白肌肉中切除一个小块（约5毫米直径，5-10毫米深）。每个组织样本放入预标记的2毫升离心管中，并立即保存在干冰上直至返回实验室。84条个体中，39个标本选择用于稳定同位素分析以评估营养位置。

DNA提取、PCR扩增和测序

胃内容物用无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2-7.6）彻底冲洗以去除乙醇和杂质，然后使用TissueLyser II（Qiagen，德国）与5毫米不锈钢珠在30赫兹下均质2分钟。约200毫克均质材料用于总DNA提取，使用 Marine DNA Extraction Kit（TIANGEN，北京，中国），遵循制造商协议，包括酶促裂解、结合到硅胶柱和乙醇基洗涤和洗脱。DNA浓度使用Qubit 4 Fluorometer（Invitrogen）测量，DNA质量通过1.2%琼脂糖凝胶电泳（Invitrogen, 75510-019）与DL2000标记（Takara）评估。

为评估饮食组成，我们采用DNA宏条形码靶向动物和植物/藻类成分。每个引物对扩增约230 bp片段，其中bp（碱基对）指DNA序列中的核苷酸对数量。引物序列如下：

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  COI 正向引物: 5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′
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  COI 反向引物: 5′-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3′
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  rbcL 正向引物: 5′-ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC-3′
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  rbcL 反向引物: 5′-CGTCCTTTGTAACGATCAAG-3′

文库构建遵循两步PCR协议。第一轮PCR在25 μL体积中进行，包含：5 μL 5× Q5 Reaction Buffer，5 μL 5× GC Enhancer，2 μL dNTPs（2.5 mM），1 μL each 正向和反向引物（10 μM），2 μL DNA模板，0.25 μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase（New England Biolabs, M0491L）和8.75 μL 无核酸酶水。热循环程序包括初始变性98°C 2分钟，随后30个循环的98°C 15秒，55°C 30秒和72°C 30秒，最后延伸72°C 5分钟。

扩增成功通过2%琼脂糖凝胶电泳使用电泳系统（北京六一，DYY-6C）确认，并通过凝胶成像系统（北京百晶，BG-gdsAUTO(130)）可视化。阳性扩增子使用AMPure XP beads（Beckman Coulter）根据制造商说明纯化。

进行第二轮PCR使用Nextera XT Index Kit（Illumina）添加双索引条形码和全长Illumina适配器。第二轮PCR产物使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen, P7589）和荧光板阅读器（BioTek FLX800T）量化，然后以等摩尔浓度混合以确保每个样本的平等代表。

混合文库随后由Illumina MiSeq Sequencing Platform（武汉天一华宇遗传科学与技术有限公司）测序。每个个体样本旨在实现最小测序深度50,000 reads。

稳定同位素比率测定

碳（δ¹³C）和氮（δ¹⁵N）稳定同位素比率使用DELTA V Advantage同位素比率质谱仪（IRMS, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）在鱼类肌肉样本上测定。稳定同位素分析是营养生态学中广泛使用的方法，用于评估消费者的长期饮食模式和营养位置。碳稳定同位素比率（δ¹³C）值反映基础碳源，而氮稳定同位素比率（δ¹⁵N）指示营养级，通过以下公式计算：

δ = [(R_sa / R_st) - 1] × 100%

其中X代表¹³C或¹⁵N，R代表¹³C/¹²C或¹⁵N/¹⁴N的丰度比。

使用SPSS 22.0软件，首先进行多元方差分析（MANOVA）以检查不同河流流域和不同食物生物之间碳（δ¹³C）和氮（δ¹⁵N）稳定同位素比率的联合差异。当MANOVA显示显著效应（Pillai’s trace test, p < .05）时，对每个同位素分别进行后续单变量ANOVA。

数据分析

为澄清祁连裸鲤的饮食组成，我们利用高通量测序技术，采用细致的生物信息学工作流程处理测序reads。原始测序数据，源自MiSeq测序，经过使用Trimmomatic软件的严格质量控制。我们实施Phred分数截断值Q30，一种碱基调用准确性的度量，指示99.9%的概率核苷酸被正确识别，以细致过滤掉质量不足的reads，确保只有最可靠的序列进入后续分析。序列拼接过程，由FLASH软件促进，是我们方法学的组成部分。这涉及合并重叠reads以重建连续序列，这是从测序平台产生的碎片化reads推断全长基因片段的关键步骤。拼接后，我们应用长度过滤器进一步精炼数据集，排除任何短于200 bp的序列以维持序列完整性。为防止某些序列在分析中过度代表，我们系统识别并消除重复条目。此外，我们基于配对reads间的重叠关系调整序列方向，这是准确序列比对和后续分析的关键步骤。处理的序列随后使用Usearch（版本7.1）软件聚类为OTUs，采用97%相似性阈值——生态研究中定义OTUs的标准。生成的OTU丰度表然后用于群落水平饮食比较。Bray-Curtis相异矩阵使用vegdist函数（vegan包v2.6-4）计算。主坐标分析（PCoA）使用cmdscale函数（R基础包）执行以可视化beta多样性模式，轴显著性通过PERMANOVA（adonis2函数，999 permutations）验证。这种聚类方法允许我们基于遗传相似性将序列分类为 distinct 分类群。最后，OTUs的分类鉴定使用RDP分类器中实施的贝叶斯算法进行，为概率分配分类提供稳健框架。这种全面和透明的分析方法确保了对河西走廊内陆河流域三大流域（黑河、疏勒河和石羊河）内祁连裸鲤食性习惯的可靠解释。

我们采用互补α-多样性指数评估流域间饮食生态位宽度的相对差异，理解这些指标反映鱼类觅食模式而非绝对猎物可用性。分析纳入多个指数以描述猎物多样性和群落结构。首先，观察到的OTUs（S_obs）用作原始分类丰富度的直接度量。为解释可能未检测到的稀有猎物物种，我们还计算了Chao1指数（Chao 1984）和丰度基覆盖估计器（ACE），它通过基于观察丰度调整缺失稀有分类单元的概率预测总物种丰富度。ACE将物种分为“稀有”和“丰富”类别，估计稀有分类单元的覆盖度，并使用此推断未检测物种数量，使其在许多猎物OTUs低频出现时特别有用。

为表征群落结构，计算了Simpson优势指数（Simpson 1949），它量化从样本中随机选择的两个个体属于同一物种的概率；较高值指示少数猎物分类单元更强优势。还使用了Shannon-Wiener指数（Shannon 1997）以评估猎物均匀度和多样性，反映猎物OTUs数量和个体分布 among them；较高值指示更大多样性和更均匀分布（Lundin et al. 2012）。所有指数值进行log(x+1)转换以满足正态性假设 prior to analysis。这些指数通过三个概念框架解释：第一，作为流域内饮食宽度的比较；第二，作为流域间的相对而非绝对度量；和第三，作为保守估计，给定本研究未直接量化的基础资源可用性中潜在环境异质性。公式如下：

S_obs = 实际观察到的OTU计数

S_chao1 = S_obs + [n(S_obs + 1) - ∑n_i(n_i - 1)] / [2(S_obs + 1)]

S_ace = S_abund + S_rare / C_ace + n_1^2 / C_ace^2 * γ_ace

D_Simpson = ∑_{i=1}^{S_obs} [n_i(n_i - 1)] / [N(N - 1)]

H'Shannon = -∑{i=1}^{S_obs} [(n_i / N) ln(n_i / N)]

C = 1 - n_1 / N

其中S_obs指数，Chao1和ACE基于OTUs的单次和双次出现（分别表示为n_1和n_2）和较高频率OTUs（n_i）的数量计算，其中N是样本中观察到的序列总数。S_abund指包含超过10条序列的OTUs数量，而S_rare指包含不超过10条序列的OTUs数量。C_ace代表所有低丰度物种（≤10次出现）中非单次出现（singleton）的比例，γ_ace是这些物种丰度的变异系数。物种多样性指数间的差异全部在SPSS 26（IBM Inc., Chicago, IL）中使用Tukey检验和单因素方差分析（ANOVA）分析显著差异，p < .05被认为统计显著。

结果

稳定同位素比率测定

MANOVA揭示了采样点间同位素特征（δ¹³C和δ¹⁵N）的显著差异（Pillai’s Trace = 0.744, F(32,92) = 1.58, p = .044），指示鱼类饮食来源和营养级的空间异质性。后续单变量分析显示δ¹³C值在各点间显著差异，站点H表现出显著富集的δ¹³C（–18.71‰ ± 1.84）相对于所有其他位置（–28.87‰ 至 ?23.07‰）。相比之下，δ¹⁵N值表现出更有限变异（7.41‰–9.74‰），显著差异仅检测于站点B和J的最低值与站点H和F的较高值之间。

测序结果分析

两个基因位点，COI和rbcL，在祁连裸鲤中通过高通量测序技术分析。在分析COI位点时，从41个样本中获得总共4,454,039条原始序列，其中有效序列达4,359,543条，每个样本平均包含106,330条序列，平均长度185.94 bp。通过在97%相似性水平对操作分类单元（OTUs）进行聚类分析，总共3439个OTUs，其中独特OTUs总数为1862。仅五个OTUs，或0.4%，常见于九个采样点样本，显示显著地理特异性。且大多数OTUs对特定采样点独特。rbcL位点从42个样本产生4,097,944条原始序列，其中4,055,846条在质量控制后保留为有效序列。平均每个样本包含96,567条序列，平均长度156.75 bp。在97%相似性聚类分析识别总共797个OTUs，其中308个独特。 among these, 22个OTUs检测 across all nine采样点，占总OTUs的6.63%。应注意，虽然这些22个OTUs存在于所有采样点，但某些站点对某些OTUs具有非常低的序列计数。应用质量控制和丰度过滤后，这些站点的观察OTU丰富度较低，这解释了 apparent discrepancy。大多数OTUs仍然对特定采样点独特。Bray-Curtis相异矩阵的PCoA揭示了祁连裸鲤饮食组成跨采样点的显著空间结构（PERMANOVA, F = 6.34, R2 = 0.12, p = .002）。COI基因分析 demonstrated strong clustering of站点H（疏勒河）、J（黑河）和D（黑河支流），而站点F（黑河支流）和G（疏勒河）显示与其他采样位置的 distinct separation。也值得注意的是，虽然对站点H和F观察到一般聚类趋势，但它们也表现出相当大的站点内变异，如个体样本的 spread 所指示。rbcL基因数据的并行分析指示站点A（石羊河支流）和站点F间的收敛饮食模式，与剩余站点间观察到的更广变异 contrasting。

Alpha多样性分析

通过应用观察物种数（S_obs）、Chao1指数、Pielou均匀度指数、Shannon多样性指数和Simpson优势指数，本研究探索了祁连裸鲤饮食多样性在不同采样点间的差异。在疏勒河站点G，高Chao1指数暗示比直接观察到的更大丰富度，指示统计推断的稀有分类单元基于低频OTUs而非新记录物种。一致地，该站点也显示最高Shannon多样性指数，反映丰富度和猎物分类单元的均匀分布。相比之下，黑河采样点F的高物种观察数突出了其物种丰富度，而黑河采样点J的低Simpson指数揭示了一个高度多样化的生态系统，暗示没有单一物种主导饮食。总之，疏勒河采样点G在两个维度上表现出显著生物多样性：未观察物种的潜在多样性和观察物种的均匀分布。相比之下，黑河采样点J在物种均匀度方面表现出显著性能，并与黑河支流采样点F相比具有更高的饮食多样性。

肉食性饮食组成分析

在去除祁连裸鲤序列和33个未识别分类单元后，在祁连裸鲤饮食中检测到总共40个属。这些属代表饮食的肉食部分，包含源自其他动物（如无脊椎动物、小鱼、浮游动物等）的猎物项目。非动物分类单元如真菌或植物病原体在分析中检测到被认为是偶然或次要项目，不包括在肉食饮食组成中。主导属在九个采样点的检测频率揭示了清晰变异。某些属，如Keratella和Polyarthra，在所有站点检测到（100%），而Phytophthora、Zanclea和Fusarium也表现出非常高检测率（100%）。其他属显示中间检测频率，包括Macrothrix（55.6%）、Phytopythium（77.8%）、Lucilia（44.4%）、Eimeria（66.7%）、Peucetia（44.4%）、Brachionus（66.7%）、Nitzschia（44.4%）、Rhabdochona（55.6%）、Bursaphelenchus（77.8%）和Fucus（88.9%）。同时，几个属仅在少数站点检测到，如Rhizophagus（11.1%）、Hybomitra（22.2%）和Nais（22.2%）。

这些属的出现和相对丰度在采样点间变化，某些分类单元（如Keratella、Polyarthra）显示广泛分布，而其他（如Macrothrix、Peucetia）限于一或两个站点，可能反映站点特异性猎物可用性、栖息地特征或微环境影响其存在的因素。这些模式指示猎物群落和河流栖息地的空间异质性塑造了祁连裸鲤饮食组成。

草食性饮食组成分析

在祁连裸鲤饮食的草食部分检测到总共95个属，包含源自植物、藻类和其他初级生产者的猎物项目。最频繁代表的属，基于样本间序列丰度，包括Myricaria、Drymocallis、Populus、Hippophae、Setaria、Artemisia、Solanum、Marichromatium、Ligusticum、Zanthoxylum、Ziziphus、Triticum、Raphanus、Potentilla、Cunninghamia、Kali、Medicago、Vaccinium、Poa和Clematis。几个属如Myricaria、Drymocallis和Populus在所有采样点检测到。每个流域识别的独特植物属数量范围从14到19。石羊河流域（站点A, B, C）和黑河流域（站点D, E, F, J）各展示14个独特属，而疏勒河流域（站点G, H）显示19个。

虽然某些属限于单个采样点——例如，Cunninghamia、Clematis和Zanthoxylum——没有属 exclusive to a single流域。大量属共享 across all three河流系统。

讨论

同位素特征的空间变异反映营养分化

观察到的祁连裸鲤δ¹³C和δ¹⁵N值的空间变异与已建立的生态原则一致，其中稳定同位素比率作为能量流动和营养结构的整合指标。在本研究中，MANOVA揭示了采样点间整体同位素差异，变异主要由δ¹³C驱动，而δ¹⁵N差异仅限于子集站点。这种模式表明来自不同河流盆地的个体同化 distinct 碳源，大多数站点间营养级分歧 modest。

δ¹³C值变异可能反映基础碳池差异，潜在受陆源碎屑、附生藻类和底栖藻类相对贡献影响。例如，在站点C（石羊河）观察到的更负δ¹³C值可能指示更高输入 from ¹³C-耗尽源如C₃陆生植物或附生藻类。相比之下，在站点H（疏勒河）观察到的相对富集δ¹³C特征可能暗示更强依赖底栖藻类或大型植物。然而，没有并发初级生产者或颗粒有机质数据，特定源归属仍然不确定。

δ¹⁵N值的空间差异可能反映营养位置变异或氮循环动态。在站点H升高的δ¹⁵N值可能指示更大消费更高营养级猎物、增强氮输入或改变食物网内微生物处理。宏条形码分析提供猎物分类单元存在和相对丰度的定性信息，可以指示猎物是更高或更低营养级。然而，因为宏条形码产生相对序列丰度而非绝对生物量或氮贡献，它不能定量解析归因于特定猎物项目的δ¹⁵N富集比例。因此，δ¹⁵N变异的解释保持 tentative，且整合同位素数据与定量饮食和环境信息将对更精确理解营养动态必要。

集体地，这些同位素模式提供了流域间营养分化和碳源异质性的广阔视角。然而，为完全解释 underlying 生态机制，稳定同位素数据应与物种水平饮食组成、食物资源可用性和栖息地特征整合。

肉食性饮食组成中的模式暗示方法学影响

肠道内容物的DNA宏条形码揭示了高比例宿主（祁连裸鲤）序列，与基于PCR的鱼类饮食分析中已知挑战一致。这可能由于肠上皮组织的共扩增，这些组织丰富且相对未降解，而饮食DNA可能更碎片化且 present in lower concentrations。虽然这种扩增偏倚使解释复杂化，一系列非宿主分类单元仍然恢复，提供潜在动物源性猎物组成的洞察。

在过滤掉宿主和未识别序列后，40个属在剩余肉食饮食数据中识别。其中几个，包括Keratella、Polyarthra和Macrothrix，和幼虫昆虫分类单元，是淡水浮游