钩端螺旋体毒力修饰蛋白（VM蛋白）检测方法的建立及其在发病机制与诊断应用中的意义

本研究开发了一种基于单克隆抗体（mAb）的捕获免疫分析法，首次在实验性仓鼠模型中成功检测到血液中的钩端螺旋体毒力修饰蛋白（VM蛋白），验证了其作为分泌性外毒素（exotoxins）介导疾病发病机制的假说。该研究为钩端螺旋体病（leptospirosis）的早期诊断提供了新思路，并为理解其致病机制及开发新型诊断工具奠定了重要基础。

　　

ABSTRACT

钩端螺旋体病是一种全球重要的被忽视的热带疾病，尽管其病原体已被发现超过一个世纪，但仍缺乏早期可靠的诊断方法。研究团队此前已鉴定出病原体特异性的旁系同源PF07598基因家族，该家族编码毒力修饰（VM）外毒素，这些毒素在钩端螺旋体病的发病机制中扮演关键角色。本研究开发了一种基于单克隆抗体（mAb）的捕获免疫分析法，用于在实验性仓鼠模型的血液中检测VM蛋白，从而验证了VM蛋白作为分泌性外毒素介导疾病发病机制的假说。针对天然变异体LA0591（一种含有保守C端DNase毒素结构域但缺乏N端蓖麻毒素B样凝集素结构域的VM蛋白）制备了单克隆抗体。通过表位作图确定了mAbs 5F8、5G10和6A5靶向的特定线性表位，并通过分型和肽段作图确认了其不同的结合区域。这些mAbs表现出与同源抗原的高亲和力结合，其解离常数（K_d）达到亚皮摩尔级别（5F8的K_d = 1.41E-09，5G10和6A5的K_d <1.0E-12），并能与在大肠杆菌（E. coli）中表达的全长重组VM蛋白发生交叉反应。免疫印迹分析显示，在模拟体内条件下，问号钩端螺旋体（L. interrogans）哥本哈根血清型L1-130菌株的VM蛋白表达量增加。利用mAbs 6A5和5F8建立的捕获ELISA法，在感染仓鼠的血清和尿液中检测到了循环的VM蛋白，证实了感染过程中这些蛋白的分泌。本研究首次提供了感染动物血液中存在分泌性钩端螺旋体外毒素的证据，增进了对钩端螺旋体病发病机制的理解，并为开发新型诊断方法奠定了基础。

IMPORTANCE

这项研究针对钩端螺旋体病这一全球健康问题，该病是一种被忽视的热带疾病，尽管已知超过一个世纪，但仍缺乏早期可靠的诊断方法。研究开发了一种使用特殊设计的抗体来检测感染仓鼠血液中与疾病相关的特定蛋白的新方法。这些蛋白与病原体的致病能力有关。成功在血液中检测到这些蛋白是一项重大进展，它不仅增进了我们对疾病进程的理解，而且为开发新的诊断工具奠定了基础。这可能带来更早、更准确的钩端螺旋体病诊断，从而有望拯救生命并减少该疾病的全球影响。

INTRODUCTION

致病性钩端螺旋体（Leptospira）是细胞外螺旋体，是钩端螺旋体病的病原体，这是一种全球重要的被忽视的人畜共患病，每年估计影响100万人，导致约6万人死亡，严重病例的病死率高达20%。临床表现从轻症到危及生命的严重表现不等。钩端螺旋体病是热带和亚热带地区的主要公共卫生挑战，特别是在卫生设施不足的地区以及飓风、强降雨和洪水等事件期间。由于气候变化的影响，其流行率预计会上升。问号钩端螺旋体（L. interrogans）是最常与人类感染相关的物种，主要通过接触受感染啮齿动物（特别是大鼠和小鼠）的尿液传播，细菌在近端肾小管中持续存在。在急性疾病期间，即所谓的败血症期感染阶段，钩端螺旋体在血液中（钩端螺旋体血症）存留至少10-14天，然后定植于肾脏。凝集抗体可在症状出现后5-7天通过ELISA检测到；然而，该方法的敏感性和特异性有限，通常需要配对的感染前和感染后血清进行准确的诊断确认。标准诊断技术，包括显微镜凝集试验（MAT）、培养和PCR，具有固有的局限性，例如假阴性结果，尤其在感染早期。基于抗原的检测方法为早期诊断和更广泛的应用提供了希望，特别是在资源有限的环境中。

研究团队先前鉴定出编码VM蛋白的旁系同源PF07598基因家族，其转录本在体外模拟宿主条件下以及体内急性感染的小动物模型中均上调，支持了它们在钩端螺旋体病发病机制中起关键作用的假说。VM蛋白是分泌性外毒素，其特征在于具有分泌信号肽、两个N端串联重复的R型凝集素结构域（RBLs）（除了LA0591同源物缺乏RBLs）以及一个具有DNase活性的C端毒素结构域。有限的重组VM蛋白（LA3490、LA0591、LA0620、LA1400和LA1402）的DNase活性已通过实验证实。然而，驱动该活性的分子机制以及负责的特定氨基酸残基仍有待阐明。尽管早期研究提出了推定的关键残基，但它们参与DNase活性尚未得到实验证实。

小鼠疫苗接种研究表明，VM蛋白显著降低了关键器官（如肝脏和肾脏）中的细菌载量（降低了10⁴倍至10⁵倍）并防止了死亡，突出了它们的治疗潜力。钩端螺旋体物种内的菌株变异影响感染动态和宿主相互作用。例如，Putz等人证明了用基因组相似性达99%的博氏钩端螺旋体（L. borgpetersenii）哈德乔血清型JB197和HB203菌株感染仓鼠会产生不同的疾病谱：JB197诱导严重的急性感染，而HB203导致无症状的慢性感染。与HB203相比，JB197在29°C和37°C下显示出Q04V07 VM蛋白（LIC12399同源物）的显著上调。

最近使用CRISPR-dCas9敲低曼尼拉血清型问号钩端螺旋体中的LIMLP11655（VMP）支持了（以及我们先前发表的工作）VMPs是钩端螺旋体病细胞发病机制中的关键毒力因子的假说，这强调了PF07598基因家族在钩端螺旋体发病机制中的潜在关键作用。同一研究组最近使用双重RNA-Seq研究了问号钩端螺旋体在感染过程中如何影响宿主和病原体基因表达。他们发现，在12个曼尼拉血清型问号钩端螺旋体PF07598编码的VM蛋白中，只有两个在转录水平表达（曼尼拉血清型问号钩端螺旋体命名法，LIMLP_11655和LIMLP_11660; 莱氏血清型问号钩端螺旋体中的同源物，LA1400和LA1402, 以及哥本哈根血清型中的LIC12340和LIC12339, 分别）。LIMLP_11660失活导致毒力完全丧失， complementation可恢复毒力。这两个VM蛋白同源物与上皮细胞紧密连接破坏、钙平衡增加有关。这些独立的研究验证了我们的假说和先前的发现，强调了VMPs是分泌的蛋白质外毒素。

本研究的目标是开发一种基于捕获ELISA的免疫分析法，用于检测实验动物样本中的病原体特异性VMP抗原，以推进钩端螺旋体病的早期诊断。在感染动物的血液、组织和尿液中检测到VMPs将支持这些钩端螺旋体分泌的外毒素正在循环并导致该感染的系统性临床表现（包括“血管炎”样综合征、休克和肺出血）的假说。我们的研究结果证明了在感染仓鼠的血清和尿液中存在钩端螺旋体VM蛋白，支持了循环VM蛋白介导疾病发病机制的假说。

MATERIALS AND METHODS

Leptospira growth and maintenance of low-passage strains in hamsters

钩端螺旋体在30°C下在半固体EMJH培养基中保存，并在液体EMJH培养基中培养。使用暗视野显微镜定期监测生长。通过12,000 × g离心收获液体EMJH培养基中的对数中期培养物。沉淀的细胞用1× PBS（pH 7.4）洗涤两次。用悬浮在1 mL 1× PBS中的2.5 × 10⁸个细胞接种远交系叙利亚金仓鼠。

仓鼠实验在动物生物安全等级（ABSL-2）条件下进行，并获得耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（Protocol 2022-20243）的批准。从Jackson Laboratories获得三周龄雌性钩端螺旋体阴性仓鼠，并在无特定病原体环境中饲养。它们被饲养在独立通风的笼子中，垫料每周更换两次，并在整个研究期间自由获取食物和水。所有程序均在兽医监督下最大限度地减少疼痛和痛苦。

每组五只4至6周龄的雄性仓鼠腹腔注射（IP）2.5 × 10⁸个钩端螺旋体/mL的哥本哈根血清型问号钩端螺旋体L1-130菌株，悬浮于1 mL 1× PBS中。每天两次监测仓鼠的疾病迹象，如食欲不振、嗜睡、呼吸困难、虚脱、毛发蓬乱和体重减轻10%。表现出严重症状的仓鼠使用CO₂按照AAALAC/AVMA指南进行安乐死，并被分类为患有严重或致死性钩端螺旋体病。无菌采集感染仓鼠的血液、肺、肝脏和肾脏，并在30°C下保存在含有5-氟尿嘧啶（5FU, 200 μg/mL）和新霉素（4 μg/mL）的半固体EMJH中。在预定时间点采集和处理眼眶后血液和尿液样本，并储存在-80°C直至分析VM蛋白。全血在室温下孵育20分钟使其凝固，并通过在4°C下1,500 × g离心10分钟分离血清。通过在开腹腹腔中直接从膀胱吸取尿液来收集仓鼠在安乐死时的尿液样本，以避免污染。然后将样本在28,000 × g下离心30分钟以分离细胞碎片和颗粒物质。上清液和沉淀部分均储存用于下游分析。对于VM的检测，我们主要分析了沉淀部分，将其重悬于100 μL 1× PBS中，因为初步实验表明VM主要与颗粒成分相关，可能是由于在囊泡中分泌或与宿主/细菌细胞相关。血液和尿液均分装以避免冻融循环，并储存在-80°C直至使用。

Cloning, recombinant protein expression, and purification

如已发表的方法表达和纯化重组蛋白。简要来说，编码PF07598蛋白的构建体——来自莱氏血清型问号钩端螺旋体的LA3490（Uniprot: Q8F0K3）、LA3490的RBL1和RBL1+2（RBLs）结构域以及LA1402（Q8F6A7）——以及来自哥本哈根血清型L1-130的LIC12340（Q72P X 7）（LA1400的莱氏同源物）和LIC12985（Q72N53）（莱氏同源物LA0591的自然变异体，仅编码VM外毒素的C端区域）从实验室库存中获得。为了生成LA0591突变体，在蛋白质序列中引入了以下定点突变：在第203位，精氨酸（R）被赖氨酸（K）取代；在第205位，组氨酸（H）被丙氨酸（A）取代；在第221位，苏氨酸（T）被丙氨酸（A）取代；在第222位，精氨酸（R）被赖氨酸（K）取代；在第254位，精氨酸（R）被赖氨酸（K）取代。这些氨基酸取代旨在评估在这些特定残基上改变电荷和极性的潜在结构和功能效应。信号后编码序列被合成并克隆到pET32b(+)中。LA3490、LA1402、RBL1和RBLs的构建体通过(Gly?Ser)?接头与mCherry（AST15061.1）融合，两侧为肠激酶位点，而全长LA1400和LA0591则在没有mCherry的情况下克隆；所有构建体均通过限制性酶切和测序进行序列和方向验证。

这些VM蛋白富含半胱氨酸，重组蛋白在SHuffleT7感受态大肠杆菌细胞中表达，因为它们具有在细胞质中促进二硫键形成的能力，确保蛋白质正确折叠。将转化子传代培养到含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C培养。当培养物达到OD 0.6时，通过添加1 mM异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在16°C和250 rpm下诱导表达24小时。诱导后，通过离心将细胞沉淀，然后在含有50单位/mL苯甲酸核酸酶、0.2 mg/mL溶菌酶和EDTA-free蛋白酶抑制剂混合物的CelLytic B（细胞裂解试剂）中裂解，并加入100 mM PMSF，在37°C下裂解30分钟。裂解物在4°C下以18,514 × g离心10分钟。分离上清液和沉淀，然后通过4%–12% bis-tris SDS-PAGE进行分析。通过BCA测定法测定蛋白质浓度。使用预先用含有100 mM NaH₂PO₄、10 mM Tris-HCl、25 mM咪唑（pH 8.0）的缓冲液平衡的1 mL预装Ni-Sepharose AKTA HisTRAP柱纯化这些重组蛋白。然后在存在500 mM咪唑（pH 8.0）的情况下从柱上洗脱结合的融合蛋白。合并洗脱液并通过30 kDa Amicon Ultra离心过滤器浓缩，重组蛋白制备物在4°C下对1xPBS（pH 7.4）温和搅拌（350 rpm）透析过夜（10 kDa截留分子量），随后通过7 kDa Zeba脱盐旋转柱去除咪唑，然后储存在-80°C直至使用。

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western immunoblot analysis

根据Laemmli的方法进行SDS-PAGE。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后用溶解在1× PBST缓冲液中的5%脱脂奶粉封闭2小时，然后用小鼠单克隆抗体（1:1,000稀释度）探测。用PBST洗涤三次后，将膜与碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgG（H + L）作为二抗（1:5,000稀释度在PBST中）孵育2.5小时。在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯和氮蓝四唑溶液（BCIP/NBT）中显色。

Generation of monoclonal antibodies

通过Precision Antibody在小鼠中生成针对信号后全长LA0591的单克隆抗体。

Bio-layer interferometry

使用生物层干涉技术（BLI）（商业上称为Octet）测量抗原和抗体相互作用及动力学。使用抗小鼠F_c捕获（AMC）浸入式读取生物传感器捕获小鼠单克隆抗体（mAb）。然后将这些探针浸入含有500 nM LA0591抗原的孔中，以测量抗原-抗体结合速率，K_d。结合亲和力（K_d）以平衡解离常数（单位：M）表示。

随后，将探针置于PBS测定缓冲液中以确定解离速率（off rate）。使用结合速率常数（K_a，单位：1 /M·s）和解离速率常数（K_d，单位：s?1）通过1:1局部拟合分析在Fortebio数据采集软件v. 8.0.0.99中计算解离常数（K_d，单位：M）。解离速率常数（K_d单位：s?1）描述了抗体-抗原复合物解离的速率，而结合速率常数（K_a单位：1 /M·s）表示抗体与抗原结合的速率。R2值表示实验数据与拟合曲线之间的拟合优度，而χ2值反映了它们之间的误差程度。χ2值在1到2之间被认为是准确的，低于1的值表示高准确性。

Binning matrix/pairing analysis

使用基于无标记BLI的夹心法进行。从培养上清液中捕获克隆至1.0 nm阈值，使用固定在生物传感器上的山羊抗小鼠Fc抗体。使用抗小鼠IgG的F(ab’)2片段（50 μL/孔在PBS中）进行淬灭，以封闭传感器上未占据的结合位点。通过添加溶液中500 nM的目标LA0591进行捕获/结合。使用捕获抗体作为基线进行自配对。检测第二个mAb与结合的目标LA0591的结合，并安排多个配对组。在PBS中进行稀释。配对的抗体用绿色突出显示。自配对或阻断效应用红色突出显示，并用作确定强配对的阈值。将小鼠混合纯化IgG作为阴性对照作为检测抗体，并显示传感器完全饱和。

Linear epitope mapping using overlapping synthetic peptides

由Mimotopes商业合成针对信号后LA0591（291 aa）的定制肽库（Pepsets），基于其独特的专有多针系统在96孔板上合成。该库包含71个肽，格式为Biotin-Spacer-Peptide-COOH。每个肽为12个氨基酸加上一个SGSG间隔基，以冻干形式提供，并储存在-20°C。用溶解在PBST中的5%牛血清白蛋白（BSA）封闭板2小时。将单克隆抗体或接种疫苗的仓鼠血清（针对ΔLA0591 +LA1402）以1:2,000稀释度加入孔中，每孔100 μL 1× PBS，并在37°C孵育1小时。用PBS的孔作为阴性对照。用PBST洗涤孔四次以去除非特异性结合，然后与抗小鼠IgG（5F8同种型-IgG1，6A5同种型-IgG2β）-HRP偶联物或抗仓鼠IgG-HRP以1:10,000稀释度在1× PBS中孵育1小时，37°C。使用100 μL即用型TMB底物显色反应，并用2 M H₂SO₄终止。使用SpectraMax M2e微孔板读数仪在450 nm处读取吸光度（光密度，OD）。

Epitope mapping using PyMOL visualization

使用PyMOL版本（TM）3.1.3.1分析LA0591（Uniprot ID: Q8F8G6, Predicted AlphaFold: AF-Q8F8G6-F1）和全长LA3490（Uniprot ID: Q8F0K3, Predicted AlphaFold: AF-Q8F0K3-F1）的三维结构，以定位保守的免疫反应性表位。表位19（NSHGPLQGGGYF）、表位20（PLQGGGYFFNTA）和表位67（NRRGSGGYPTSA）分别用红色、蓝色和绿色编码，并映射到每个蛋白质的表面结构上。

Multiple sequence alignment

使用Jalview V2.11.4中的默认设置，通过 pairwise MUSCLE蛋白质比对对mAbs和来自莱氏血清型问号钩端螺旋体（n = 12）和哥本哈根血清型L1-130（n = 13）的PF07598基因家族编码VM外毒素的旁系同源物及其在博氏钩端螺旋体中的直系同源物（两个旁系同源物，1: LIC12844的直系同源物；三个相同拷贝，和2: LIC12399）进行顺序比对。使用Jalview V2.11.4中的 pairwise alignment确定百分比同一性。

Leptospiral expression of virulence-modifying proteins determined by western immunoblot

先前，我们证明了VM蛋白在仓鼠急性钩端螺旋体病模型中体内转录上调。为了优化其体外表达，在模拟体内宿主环境的条件下培养钩端螺旋体，已知该条件可诱导毒力基因表达。通过12,000 × g离心收获未修饰EMJH培养基中的对数中期培养物。沉淀的细胞用1× PBS洗涤两次，重悬于补充有120 mM NaCl的液体EMJH培养基中，然后在37°C孵育4小时。将沉淀的细胞重悬于200 μL含有蛋白酶抑制剂混合物的Bug-buster试剂中，并通过在4°C下12,000 × g离心10分钟分离无细胞裂解物。通过 western blot 分析诱导和未诱导（对应于基线体外表达）的无细胞裂解物，用上述单克隆抗体探测。通过BCA测定法估算总蛋白。

Indirect ELISA

如前所述进行间接ELISA，使用96孔ELISA板。每孔用100 ng VM抗原（摩尔比，LA0591和RBLs）在100 μL 0.05 M碳酸钠缓冲液（pH 9.6）中包被，并在4°C孵育过夜。用PBST中的5%牛血清白蛋白（BSA）封闭板2小时，随后与100 μL mAbs在5% BSA的PBS中从1 μg/mL开始进行2倍系列稀释孵育1小时，37°C。用PBST洗涤孔四次以去除非特异性结合，然后与抗小鼠IgG-HRP偶联物（1:10,000）孵育1小时，37°C。使用100 μL即用型TMB底物显色反应，并用2 M H₂SO₄终止。在450 nm处读取OD。重组LA0591作为阳性对照，RBLs和 secondary antibodies 作为阴性对照。

Optimization of capture ELISA

通过进行包被mAbs在1 μg/mL的系列稀释和对照重组蛋白（LA0591和RBLs）恒定100 ng/孔浓度的以下组合，优化了用于评估抗体对和特异性检测血清、血液和尿液中VM抗原的捕获ELISA：（i）. 6A5作为捕获抗体和5F8作为检测抗体，（ii）5F8作为捕获抗体和6A5作为检测抗体，以及（iii）5G10作为捕获抗体和6A5作为检测抗体。通过改变抗原浓度并测试1 μg/mL的不同捕获和检测抗体对进行进一步优化：（i）6A5作为捕获抗体和5F8作为检测抗体，以及（ii）5F8作为捕获抗体和6A5作为检测抗体。将稀释的捕获抗体（100 μL/孔）添加到96孔ELISA板中，并在4°C孵育过夜。用1× PBST洗涤板四次，并用PBS中的5% BSA（300 μL/孔）封闭，并在37°C孵育2小时。洗涤板并与VM抗原在37°C孵育1小时。用1xPBST洗涤板四次后，将检测单克隆抗体（1:5,000）添加到孔中，并将板在37°C孵育1小时。将板与HRP偶联的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1:10,000稀释于0.05 % PBST中）孵育，添加到ELISA板（100 μL/孔）中，并在室温孵育1小时。洗涤四次后，加入100 μL TMB，反应用2M H₂SO₄终止。

Biotinylation of detecting 5F8 monoclonal antibody

使用Pierce抗体生物素化试剂盒根据制造商的说明对纯化的5F8 mAb进行生物素化。简要地，通过向含有1 mg EZ-Link NHS-PEG4-生物素的微管中加入100 μL超纯水制备8.5 mM生物素储备液。将5F8 mAb（MW 150 kDa）的浓度调节至1 mg/mL。为实现50倍过量的生物素，将7.84 μL生物素储备液加入200 μL 5F8 mAb中，并通过轻轻上下移液混合。将管在室温下孵育反应30分钟，然后用7 kDa Zeba Spin脱盐柱脱盐，并通过抗体生物素化检测试剂盒确认抗体生物素化。

Detection of VM exotoxins in experimentally infected hamster blood samples

使用优化的6A5捕获和5F8检测抗体对来筛选和检测仓鼠血清样本中的VM外毒素。简要地，将1 μg/mL捕获抗体（100 μL/孔）添加到96孔ELISA板中，并在4°C孵育过夜。

用PBS中的5% BSA封闭板，并在37°C孵育2小时。用PBST洗涤板四次，并与1:50稀释的仓鼠血清/尿液在37°C孵育1小时。用1× PBST洗涤四次后，将板与100 μL/孔的50 mol生物素化检测5F8单克隆抗体（1 μg/mL）在37°C孵育1小时。将板与链霉亲和素-HRP（1:200）在37°C孵育1小时。使用100 μL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）显色反应，并用2M H₂SO₄终止。重组LA0591作为阳性对照，测定稀释剂作为阴性对照。计算所有样本OD₄₅₀ nm的平均值（x）和标准偏差（SD）。使用标准曲线中测得的LA0591量进行插值。

Statistical analysis

实验进行三次并重复两次。数据表示为平均值±SD，并通过非参数Mann–Whitney检验分析以确定各组之间的显著差异，当P < 0.05时被认为具有统计学意义。使用Graph Prism版本8进行分析和生成图表。最终图表在Illustrator版本25.2中生成。

RESULTS

Quantitative analysis of the binding kinetics of newly developed anti-virulence-modifying protein monoclonal antibodies

VM外毒素由单个基因编码为多肽，可能寡聚化成完全活性的外毒素（约640个氨基酸）。寡聚化是多种细菌外毒素（包括炭疽毒素和李斯特菌溶血素O）的公认激活机制。然而，VM外毒素形成同源寡聚体的直接证据仍有待建立，需要进一步研究。

PF07598基因家族通常编码具有碳水化合物结合受体（RBL）结构域和C端毒素结构域的变体。相比之下，LA0591是一种独特的天然变体，完全缺乏RBL