壳聚糖生产方法调控受体介导的免疫反应但不影响靶向抗菌活性

本研究针对壳聚糖生产方法对其生物活性的影响机制不明确的问题，系统比较了异相脱乙酰化(HTDA)与化学N-乙酰化(CNA)两种方法生产的壳聚糖。研究发现HTDA壳聚糖因其更规则的乙酰化模式(PA)和更高丰度的乙酰化片段，能显著增强植物和人类细胞的受体介导免疫反应(CERK1/TLR2)，而抗菌活性不受生产方法影响。这一发现为农业和生物医学领域精准选择壳聚糖提供了重要依据。

　　

在当今气候和可持续发展危机背景下，生物经济转型迫在眉睫。甲壳素作为自然界最丰富的线性生物多糖之一，广泛存在于甲壳类动物外骨骼、昆虫外壳和真菌细胞壁中，其部分脱乙酰化衍生物壳聚糖因其独特的生物活性和应用潜力备受关注。然而壳聚糖的生物活性高度依赖于其结构参数，包括聚合度(DP)、乙酰化程度(FA)和乙酰化模式(PA)等。目前研究多聚焦于DP和FA的影响，而生产方法对壳聚糖生物活性的影响却长期被忽视。

近期研究表明，不同生产方法可能导致壳聚糖具有截然不同的乙酰化模式：异相脱乙酰化(HTDA)生产的壳聚糖表现出更规则的乙酰化模式，乙酰化单元每三个位置出现一次；而化学N-乙酰化(CNA)生产的壳聚糖则呈现随机乙酰化模式。这种结构差异是否会影响其生物活性，特别是在受体介导的免疫反应和靶向抗菌活性方面的差异，成为研究人员关注的核心问题。

为了系统解答这一问题，德国明斯特大学的研究团队在《Carbohydrate Polymers》上发表了最新研究成果。研究人员通过多种先进技术手段，包括尺寸排阻色谱联用多角度激光光散射和折射率检测(SEC-MALLS-RI)、酶解质谱指纹分析、化学发光法检测活性氧(ROS)以及TLR2报告基因细胞检测等，对来自不同供应商的HTDA和CNA壳聚糖进行了全面表征和生物活性评价。

研究团队首先筛选了九种结构特征明确的壳聚糖样品（五种HTDA和四种CNA），这些样品在分子量和平均FA方面相近，但在乙酰化模式上存在显著差异。通过酶解质谱指纹分析发现，HTDA壳聚糖具有更高的三链强度，表明其乙酰化单元更倾向于每三个位置出现一次。

在抗菌活性方面，研究发现所有壳聚糖样品对真菌 Fusarium graminearum 和细菌 Pseudomonas syringae pv. tomato 都表现出强烈的抑制效果，半最大抑制浓度(IC₅₀)值较低。重要的是，HTDA和CNA样品之间的抗菌活性没有显著差异，表明生产方法不影响壳聚糖的靶向抗菌生物活性。这一发现与壳聚糖的抗菌机制主要与其聚阳离子特性相关的观点一致，而这种特性主要取决于FA而非PA。

然而在受体介导的免疫反应方面，结果却截然不同。通过检测植物细胞外和细胞核内活性氧爆发，研究人员发现HTDA壳聚糖能引发强烈的剂量依赖性氧化爆发反应，特别是在中等FA样品中效果最为显著。相比之下，CNA样品即使在高浓度下也只能引发微弱的反应。在人类细胞实验中，HTDA样品（特别是H22和H24）能强烈激活Toll样受体2(TLR2)信号通路，而CNA样品则无法引发显著的TLR2介导的反应。

为了探究这种差异的分子机制，研究人员进一步分析了壳聚糖中高度乙酰化片段的丰度。通过 chitosanase Csn-174 酶解和SEC-MS分析发现，HTDA壳聚糖中含有更多长度≥4个乙酰化单元、FA>0.6的高度乙酰化片段。这些片段被认为是受体识别和激活的关键结构基序。值得注意的是，尽管C30样品（CNA，FA=0.30）也含有丰富的高度乙酰化片段，但其免疫激活能力却很弱，这表明除了乙酰化片段的丰度外，乙酰化单元的具体排列模式(PA)也至关重要。

研究人员提出了两种可能的机制解释HTDA壳聚糖更强的免疫活性：一是HTDA过程可能导致壳聚糖分子中含有更多能被受体高亲和力结合的A-rich片段；二是HTDA壳聚糖更规则的PA可能更符合受体亚位点的偏好。特别是植物几丁质受体CERK1及其共受体可能更偏好乙酰化单元位于特定位置（如第1、4、7或2、5位）的配体，而HTDA壳聚糖每三个位置出现乙酰化单元的规律模式恰好满足这一要求。

该研究的结论具有重要意义：壳聚糖的生产方法对其受体介导的免疫活性有决定性影响，但对靶向抗菌活性无显著影响。这一发现为不同应用场景下壳聚糖的精准选择提供了科学依据：在农业领域，需要强免疫激活作用的作物保护剂可优先选择HTDA壳聚糖；而在生物医学领域，需要低免疫反应的伤口敷料等应用则可能更适合选择CNA壳聚糖。研究人员强调，未来的壳聚糖研究和应用中必须明确标注生产方法，以确保结果的可重复性和应用效果的可预测性。

这项研究不仅深化了我们对壳聚糖结构-功能关系的理解，也为基于壳聚糖的精准生物材料设计提供了重要指导。随着对壳聚糖受体识别机制的进一步解析，未来有望实现基于特定应用需求的定制化壳聚糖生产，推动这一天然高分子在农业、医学和食品工业等领域的更广泛应用。