ROCK2作为RNA结合蛋白通过调控PAI-1/NLRP3轴及衰老逃逸促进肾细胞癌进展的机制研究

本研究揭示ROCK2通过结合PAI-1 mRNA激活NLRP3炎症小体，抑制细胞衰老并促进线粒体自噬，最终驱动肾细胞癌（RCC）进展。靶向ROCK2/PAI-1/NLRP3轴或可成为RCC治疗新策略。

　　

Highlight

PAI-1表达在ROCK2敲低（KD）的786-O细胞中下调并与RCC患者生存结局相关

我们前期研究发现ROCK2对维持肾细胞癌（RCC）发展至关重要。为探究特定细胞因子是否参与ROCK2介导的RCC进展，我们通过细胞因子阵列比较了shNC和shROCK2 786-O细胞上清液的细胞因子谱。在阵列检测的36种细胞因子中，IL-6、IL-8、MIF和PAI-1变化最显著并被选作后续验证。Western blotting证实ROCK2 KD显著降低了PAI-1的蛋白表达水平。通过TCGA-KIRC数据集分析发现，PAI-1在RCC组织中显著高表达，且高表达PAI-1的患者总生存期更短。这些结果表明PAI-1可能是ROCK2促进RCC进展的关键下游因子。

PAI-1过表达逆转了ROCK2 KD诱导的细胞衰老并促进线粒体分裂

我们既往研究表明ROCK2 KD可诱导RCC细胞衰老。本研究中，SA-β-gal染色显示ROCK2 KD显著增加细胞衰老，而PAI-1过表达有效逆转了此现象。进一步实验发现PAI-1过表达通过增强Drp1^Ser616位点磷酸化促进线粒体分裂，并通过增加LC3-II/LC3-I比值和降低p62表达诱导线粒体自噬。透射电镜直观呈现了PAI-1过表达组中线粒体碎片化和自噬体形成的特征。这些发现表明PAI-1通过调控线粒动力学对抗ROCK2缺失引发的衰老效应。

PAI-1通过激活NLRP3炎症小体抑制细胞衰老

为探究PAI-1抑制衰老的机制，我们检测了NLRP3炎症小体通路。Western blotting显示ROCK2 KD降低NLRP3、caspase-1和IL-1β表达，而PAI-1过表达显著激活这些指标。使用NLRP抑制剂MCC950处理后，PAI-1介导的衰老抑制效应被完全逆转，SA-β-gal阳性细胞率重新升高。同时，MCC950处理阻断了PAI-1对线粒体分裂和自噬的促进作用，表现为Drp1磷酸化水平下降和LC3-II/LC3-I比值降低。表明PAI-1是通过激活NLRP3炎症小体通路来发挥作用的。

体内实验证实PAI-1通过NLRP3促进肿瘤生长

通过裸鼠成瘤实验验证体内效应，PAI-1过表达组肿瘤体积和重量显著增加，肿瘤组织Ki-67阳性率升高而TUNEL阳性率降低。当联合使用MCC950后，PAI-1促进的肿瘤生长被明显抑制，凋亡细胞比例回升。免疫组化显示MCC950处理组肿瘤中NLRP3和cleaved caspase-1表达显著下调。这些体内数据充分证明PAI-1是通过激活NLRP3炎症小体来促进肿瘤生长并抑制凋亡的。

ROCK2直接结合PAI-1 mRNA并增强其稳定性

为阐明调控机制，我们通过RNA免疫共沉淀（RIP）实验证实ROCK2可直接结合PAI-1 mRNA。放线菌素D处理后的mRNA稳定性检测显示，ROCK2 KD组PAI-1 mRNA半衰期显著缩短，而PAI-1过表达可恢复mRNA稳定性。表明ROCK2作为RNA结合蛋白通过增强PAI-1 mRNA稳定性来调控其表达。

Discussion

尽管靶向治疗和免疫治疗取得进展，肾细胞癌（RCC）仍是全球发病率和死亡率持续上升的难治性恶性肿瘤。约25%患者在确诊时已发生转移，另有25%患者在根治性手术后出现转移[21,22]。虽然免疫治疗（尤其与酪氨酸激酶抑制剂联用）显著改善了生存结局，但持久应答仍较少见。