综述：通过采后设施环境微生物组监测提升食品安全

本综述系统阐述了如何利用微生物组（Microbiome）分析革新采后加工环境的监测策略。文章指出，传统针对特定病原体或指示菌的监测方式存在局限，而高通量测序（HTS）和宏基因组学（Metagenomics）技术能全面解析环境微生物群落，从而更有效评估清洁消毒（C&S）效果、追踪污染源、预测食源性病原体（如L. monocytogenes）并开发新型生物防控（Biocontrol）策略，为食品安全管理提供全新视角。

　　

Introduction

采后加工设施中的微生物组对食品安全至关重要。传统环境监测通常针对特定微生物（如相关危害或指示菌），却忽略了整体环境微生物群。高通量测序（HTS）技术的进步，特别是鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics），彻底改变了我们对食品系统微生物群落的研究方式，使我们能够进行更全面的种群特征分析、功能基因识别和代谢途径表征。当前对微生物动态和相互作用的了解表明，不同食品加工和包装环境中的微生物群落组成和功能可作为环境监测的综合工具。详细理解微生物群落组装参数为预测病原体存在及研究消毒剂抗性提供了基础。

Environmental testing and the validation and verification of cleaning and sanitation

清洁消毒（C&S）是采后设施中用于减少环境微生物负载和消除潜在病原体的干预策略。环境细菌通常被视为重要的卫生指标，常通过测定特定种群的可计数来验证C&S效果。然而，这种针对性方法固有地忽略了C&S对加工厂环境中整体微生物群落的影响。通过直接测序采用更全面和非针对性的方法，越来越明显地看到，加工设施中实施的C&S是塑造微生物群落组成的驱动因素。

C&S协议对细菌和真菌群落有不同的影响，并可能导致抗性和致病类群的选择。例如，在苹果包装厂的一项调查中，应用脱蜡剂、氯化碱性泡沫清洁剂和230 ppm的过氧乙酸后，Piscicoccus和Shinella成为优势属，而C&S前优势属为Acinetobacter、Pseudomonas、Microbacterium和Acidovorax。C&S也影响了真菌种群，C&S前最丰富的真菌是Penicillium、Aureobasidium和Yarrowia，C&S后变为Astraeus和Aureobasidium。值得注意的是，虽然在此研究中Pseudomonas在C&S后优势度降低，但其他研究表明C&S后Pseudomonas属占主导地位，例如在家禽加工厂的研究中，C&S后Pseudomonas在两个工厂均占主导，尽管使用的消毒剂不同。C&S后Pseudomonas的优势也在其他商品（如新鲜农产品、鲑鱼和鲶鱼加工）的设施中观察到。这可能是由于加工过程中盛行的不同条件（特别是温度、相对湿度和食品商品）对微生物群落内个体种群的不同影响。

近年来，提出并测试了替代消毒方法。在肉类加工厂实施的臭氧处理被发现选择性灭活嗜冷细菌；40或20 ppm臭氧处理显著减少了Carnobacterium、Pseudomonas和Brochothrix的丰度，而Staphylococcus和Streptococcus属以及Propionibacterium和Burkholderiaceae科表现出抗性。

假设C&S实践降低了采后设施中的整体微生物多样性。在肉类和乳制品加工厂进行的一项调查研究中，非食品接触表面显示出比食品接触表面显著更高的微生物丰富度，为这一假设提供了一个证据。然而，最近的研究也表明C&S的影响可能是短暂的。Wang等人评估了强化卫生对牛肉设施中微生物群的影响。元分类学结果表明，强化卫生一周后群落多样性下降；但处理四周后多样性显著增加。因此，采后设施中C&S引起的现有环境微生物群落的破坏可能导致不良后果。微生物群生态和代谢功能的意外变化可能促进不受欢迎物种（如人类病原体）的定植和过度生长。建议每当实施新的消毒剂或超常规强化C&S程序时，对此类实践进行全面评估，包括对目标病原体和整体微生物组的短期、中期和长期影响。环境监测计划对食品制造设施至关重要。在微生物群分析的支持下，对清洁和消毒程序进行更全面的评估使行业能够主动识别、控制和预防生产环境和最终产品中的食源性病原体。

Contamination source tracking and hot spot characterization

能够在整个采后设施中以高分类分辨率定义种群，我们现在可以推断出精确的污染路线。元分类学/宏基因组测序和分析流程的应用，如使用SourceTracker和共现网络，可以自信地识别主要污染源。例如，在猪肉设施中，抛光隧道（包括从喷嘴、水、尤其是鞭子收集的样本）对肉类样本的微生物群落贡献最大，其次是去内脏步骤中使用的围裙、手套和刀具。宏基因组学分析还允许将微生物精确定位到特定位置；在肛门拭子样本中检测到Escherichia，而预测Lactococcus、Staphylococcus、Chryseobacterium和Moraxella物种从不同位置传播到最终猪肉产品。源追踪还允许识别最终产品微生物群的主要贡献者。Valentino等人表明，与食品接触和非食品接触表面（约10-39.2%）相比，初始原材料对最小加工蔬菜中最终微生物组的贡献更大（约25-65%）。类似地，Kim等人表明生牡蛎是最终牡蛎产品（新鲜或冷冻）的主要污染源。然而，Li等人表明加工环境中的微生物群贡献了高达62.4%的鲶鱼片微生物群。虽然这些研究中使用的不同食品商品和各种加工步骤是得出不同结论的原因，但强调了通过环境采样识别商品特异性污染源的重要性，从而有助于设计更稳健的食品安全计划。

某些食源性微生物以其在采后环境中持续存在的能力而闻名。这种持续性通常涉及特定菌株，似乎与工厂中的特定位置有关，导致重复污染（热点）。Listeria monocytogenes是一种因其在采后环境中持续存在的能力及其频繁涉及可追溯至设施污染的食品安全事件而受到高度关注的微生物。通过环境采样结合这些点的近期微生物分析，识别Listeria spp.或L. monocytogenes的污染热点，作为开发更有针对性的风险评估和缓解策略的基础。在采后环境中，例如排水管已被确定为持续分离出L. monocytogenes的区域之一。最近的微生物分析研究表明排水管中微生物群的一致性和稳定性。在猪肉设施开放初期（第0天至第50天）从排水管收集的样本与其他表面的样本分开聚类。在三个牛肉加工厂五个不同位置（hotscale、hotbox、冷却器、加工和研磨室）的排水管样本中，在两个不同时间点（2017/2018 vs. 2021）的微生物多样性在工厂或位置之间没有显示根本差异（p>0.05）。β多样性的PCoA图也没有显示任何明显的组聚类，表明排水管中驻留微生物的位点特异性关联。打蜡区是另一个新发现的L. monocytogenes热点。假设蜡残留通过形成减少消毒剂扩散的保护性涂层，为L. monocytogenes创造了有利的微环境。最近的研究证明了打蜡过程中潜在的交叉污染风险。Ruiz-Llacsahuanga等人评估了不同清洁和消毒方法对打蜡设备的功效，表明有效的蜡去除对于高效消毒至关重要。使用宏基因组测序，Tan等人显示了干燥、清洗和打蜡区域高Pseudomonadaceae相对丰度与在这些相同地方识别的L. monocytogenes最高发生率之间的联系。

Foodborne pathogen ecology and biocontrol

微生物物种之间的相关性是使用宏基因组信息进行病原体预测的基础假设。Botta等人显示了肉类设施中属于Staphylococcus、Streptococcus、Acinetobacter和Achromobacter的微生物物种之间的正成对相关性。正相关表明细菌属可能共存，归因于它们在微环境中的相互作用、它们对相同生存或生长条件的偏好、相同的污染模式和/或共享的排除其他物种的潜在能力。

如表1所示，通过培养依赖性Listeria spp.和/或Listeria monocytogenes检测与培养独立性测序相结合，已识别出与Listeria存在正相关的细菌和真菌属。

这里总结的相关性可被视为支持一种方案的初步证据，在该方案中，元分类学/宏基因组数据用于预测加工环境中病原体的存在。为了进一步推进这个方向，有必要从更广泛的食品和加工厂类型中收集额外数据。在大多数情况下，相关性是通过结合微生物群数据和目标病原体的培养基础检测来建立的。考虑到培养基础方法的局限性（例如，耗时），需要绕过培养步骤，直接在其生态位微生物组中检测和确认目标的存在（例如，使用逆转录聚合酶链反应）。此外，建立这种联系将受益于更好地理解观察到的正相关中隐含的生物学过程。这一进展将有助于将相关性转化为因果关系。

虽然正相关物种可以促进预测Listeria的存在，但通过宏基因组测序识别负相关类群，特别是识别那些可存活但难以培养的物种，有助于设计竞争排除（CE）物种的针对性回收和分离方法。这进而导致它们在排除和控制加工厂中Listeria持续性（例如生物防治）中的应用。Lake及其同事测试了L. monocytogenes与从蘑菇加工厂获得的九种环境细菌分离株共培养时的行为。当与L. lactis、L. garviae和L. raffinolactis共培养时，L. monocytogenes计数在共孵育24至48小时之间下降。Dygico等人从蘑菇生长基质中分离出Lactococcus lactis subsp. lactis，该分离株表现出抗李斯特菌和抗李斯特菌生物膜能力。Wang等人从乳制品和家禽废物中鉴定出40个分离株，包括20个Bacillus spp.分离株、12个Kocuria spp.分离株、4个Paenibacillus spp.分离株、1个Brevibacillus spp.分离株和3个Planococcus spp.分离株。当与CE菌株在乳制品和家禽堆肥及堆肥提取物中共培养时，L. monocytogenes的生长潜力降低。最重要的是，Wang等人研究中的CE分离株被证明是竞争性生物膜形成者。由于L. monocytogenes形成生物膜的能力使其能够在各种环境中建立和持续存在，相信具有更强生物膜形成能力的CE菌株可能能够预防或破坏L. monocytogenes的生物膜形成。

Resistance to sanitizers and antibiotics

尽管检测食品或食品加工环境中抗生素抗性基因（ARGs）的公共卫生意义仍需完善，但从宏基因组数据中推断抗性组目前是一种广泛实践，并作为衡量ARGs在食品系统中流行和扩散以及评估微生物群落内ARGs模式演变的手段。此外，由所有移动遗传元件（MGEs）组成的移动组也从宏基因组数据中推断出来，相信MGEs不仅影响微生物群落的组成，还影响ARGs和毒力因子的传播。

Barcenilla等人的一项研究表明，加工环境显示出比原材料和最终产品更高数量的ARGs和毒力因子。通过一项纵向研究，Cobo-Diaz等人报告说，随着猪肉设施使用时间的增加，ARGs和MGEs的丰度和多样性演变。新猪肉设施早期检测到的主要ARGs组与β-内酰胺类抗性有关。在后期运营期间，传达对氨基糖苷类、四环素类以及大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素类和截短侧耳素类抗性的ARGs相对丰度增加。最近的研究还表明，为卫生目的应用某些杀菌剂可能通过诱导消毒剂和抗生素抗性的共选择而进一步复杂化食品链中的抗菌剂抗性问题。氢氧化钠、季铵化合物（QACs）、次氯酸钠、过氧乙酸和过氧化氢是食品工业中最常用的消毒剂。在肉类和乳制品设施中鉴定出QAC抗性基因，作为C&S协议对加工设施中微生物群和ARGs影响的证据；在食品接触表面上发现比非食品接触表面更高丰度的QAC抗性基因。

超越描述性分析以理解微生物组内ARGs和MEGs的公共卫生影响，将遗传水平信息与表型观察相关联非常重要。因此，建议未来研究将培养基础确认与宏基因组分析相结合。Yi等人使用宏基因组学和培养依赖性方法评估了农场乳制品加工厂中微生物群和抗菌剂抗性的动态。从宏基因组和细菌分离株中检测到质粒介导的ARGs bla_TEM和bla_SHV（赋予对β-内酰胺抗生素抗性的基因）有助于确认乳制品链中的AMR风险。同时，在宏基因组中检测到ARGs但在细菌分离株中未检测到，表明从给定样本中培养所有抗性细菌面临的挑战，进一步强调了在AMR研究中结合培养依赖性和培养独立性方法的重要性。

Outlook

宏基因组学是目前食品微生物生态学研究中所追求的方法。为了充分利用其应用并获得食品系统微生物组的有价值见解，需要改进和调整。一个正在解决的问题是从低生物量样本（例如从设备表面和不同食品接触和非食品接触表面收集的样本）中回收和提取足够量的DNA。当前食品加工环境的采样程序是为分离和计数微生物而开发的。随着C&S协议的实施，使用当前采样协议可以回收的遗传信息受到损害，使下游测序和分析具有挑战性。Barcenilla等人研究了环境拭子采样和样本处理协议的优化，获得了改进的DNA产量（>98%样本中>10 ng，57.1%样本中>500 ng），允许每个拭子样本生成约12.2个宏基因组组装基因组（MAGs）。超越样本收集，在DNA提取、测序以及生物信息学与统计数据分析和解译的步骤中，优化和标准化程序不断演变。

在微生物食品安全的背景下考虑测序，特别是宏基因组学，必须认识到由于食品和食品加工环境微生物群落中食源性病原体的低流行率以及更重要的低丰度而存在固有局限性。因此，几乎总是需要结合针对性方法（培养基础或分子方法），以允许准确检测食源性病原体。此外，在探索加工厂微生物群落生态方面时，必须将食源性病原体识别到物种以下的分类水平，理想情况下通过分子生物分型。目前，当可以重建MAGs时，宏基因组数据提供了这种可能性。因此，可能需要测序深度和/或富集（减少时间）在准宏基因组学方法中来直接检测和环境样本中的型别/追踪食源性病原体。

依赖DNA测序的研究在很大程度上仍然是描述性的，允许提出关于食品系统微生物组的假设。因此，整合多种组学方法被认为是发现微生物组如何形成并推断微生物相互作用机制细节的前进方向。组学整合已被用于揭示微生物组在食品产品质量和安全中的作用。同样，组学将用于加工厂环境监测的背景，并通过计算方法和先进的机器学习程序对数据进行价值化。最终，加工厂微生物组将被如此详细地表征，以允许彻底的管理和增强微生物食品安全。虽然本文更侧重于微生物食品安全，但微生物群分析对改善微生物食品质量的深远影响不容低估。在Li等人进行的研究中，从鱼片和加工厂中识别出腐败细菌Pseudomonas，突出了环境卫生对食品质量和保质期的影响，以及如何利用微生物污染源追踪来改善微生物食品质量。我们确实承认每个设施建立微生物群基线或C&S效率基线会产生初始成本。然而，我们相信微生物群数据的长期益处是充满希望的。