不同链长全氟烷基物质(PFAS)通过细胞膜通透性与能量代谢调控抗生素抗性基因(ARGs)接合转移的机制研究

本研究针对全氟烷基物质(PFAS)污染对微生物生态系统的潜在风险，系统探讨了短链(PFBA、PFHxA)与长链(PFNA)PFAS对质粒介导的抗生素抗性基因(ARGs)水平转移的影响机制。研究发现PFAS对ARGs接合转移呈现浓度依赖性双相效应：低浓度(<0.05?mg/L)通过增加细胞膜通透性和活性氧(ROS)水平促进转移，而高浓度(>0.05?mg/L)通过抑制三磷酸腺苷(ATP)产生抑制转移。特别值得注意的是，短链PFBA因分子量较小更易进入细胞，表现出更强的双相效应。该研究为评估新型PFAS替代品的环境生态风险提供了重要理论依据。

　　

在当今环境污染治理领域，全氟烷基物质(Per- and polyfluoroalkyl substances, PFAS)作为一种新兴的持久性有机污染物，正日益成为科学界关注的焦点。这些具有特殊疏水性和稳定性的化学物质被广泛应用于防水涂层、电镀和家电制造等领域，但其强电子负性和C-F键的高键解离能(>110?kcal/mol)使其能够在环境中持久存在。随着国际社会对传统长链PFAS(如全氟辛酸PFOA和全氟辛烷磺酸PFOS)的限制，短链PFAS替代品的使用量逐年增加，目前全球氟聚合物年产量已超过23万吨。

令人担忧的是，短链PFAS在水环境中的检测频率和浓度显著高于长链PFAS，调查显示在黄河水系统中短链PFAS占总PFAS的89%，而污水处理厂甚至饮用水设施中全氟丁酸(PFBA)和全氟己酸(PFHxA)的检出率达到100%。更严重的是，这些短链PFAS对水生生物、植物和细菌都能产生生长抑制、生殖障碍和基因毒性效应，其环境持久性和危害特征与传统PFAS相当。

在此背景下，细菌作为自然和工程水系统中无处不在的微生物群落，可能对短链PFAS暴露产生特殊的生理响应，进而改变遗传信息传递机制。水平基因转移(Horizontal gene transfer, HGT)能够促进细菌间遗传物质的传播，是抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes, ARGs)和金属抗性基因(Metal resistance genes, MRGs)传播的关键机制。抗菌素耐药性(Antimicrobial resistance, AMR)的不断扩散被认为是本世纪最紧迫的公共卫生危机之一，而MRGs的共存不仅扩大了细菌的多重耐药性，还提高了双重耐药微生物载体的致病潜力和环境流动性。

为了深入解析短链PFAS对质粒介导的水平基因转移的影响，南京农业大学的研究团队开展了一项系统性的机制研究。研究人员选取PFBA和PFHxA作为短链PFAS代表，PFNA作为长链对照，建立了大肠杆菌DH5α(携带RP4质粒)为供体菌、大肠杆菌HB101为受体菌的接合转移模型。研究设置了从0.0005?mg/L到2?mg/L的浓度梯度，模拟自然水体和废水中的PFAS暴露水平以及极端条件下的高浓度暴露情况。

研究团队采用了多种先进技术方法：通过流式细胞术检测细胞膜通透性变化；使用荧光探针DCFH-DA测定细胞内活性氧(ROS)水平；采用改良热提取法分离分析胞外聚合物(EPS)组成；通过扫描电子显微镜(SEM)观察细胞形态变化；运用实时定量PCR和转录组测序技术分析基因表达差异；并采用分子对接技术研究PFAS与膜蛋白的相互作用机制。

研究结果揭示了PFAS影响ARGs接合转移的精细调控机制。在接合转移频率方面，研究发现所有三种PFAS都表现出典型的"先促进后抑制"的双相效应。低浓度PFAS(0.0005-0.05?mg/L)显著促进接合转移，其中0.001?mg/L PFBA使转移频率增加2.50倍；而高浓度PFAS(0.5-2?mg/L)则产生抑制作用，2?mg/L PFBA使转移频率降低77%。值得注意的是，短链PFBA表现出最强的剂量依赖性双相效应，而长链PFNA的效应相对较弱。

在氧化应激响应方面，研究发现低浓度PFBA使供体菌ROS产量增加1.27倍，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性提高1.26倍。有趣的是，虽然长链PFNA诱导了更强的ROS响应(1.26-1.78倍)，但造成的细胞损伤反而弱于PFBA。通过添加ROS清除剂硫脲的实验证实，ROS在PFAS调控接合转移过程中起着关键作用，特别是在PFBA处理组中，硫脲对接合频率的抑制率达到75%-93%。

细胞膜通透性研究显示，0.05?mg/L PFBA、PFHxA和PFNA分别使供体菌膜通透性增加1.008、1.005和1.033倍。扫描电镜观察发现，0.05?mg/L PFBA处理导致细胞膜出现轻微皱褶和损伤，但细胞间接触增加，并观察到菌毛桥的形成；而2?mg/L PFBA则引起细胞收缩、膜皱褶增加和孔洞形成，伴随絮凝和聚集现象。基因表达分析显示，2?mg/L PFBA处理下外膜蛋白编码基因ompA、ompC和ompF表达下调。

在胞外聚合物(EPS)调控方面，研究发现蛋白质主要存在于紧密结合EPS(TB-EPS)中，所有三种PFAS处理都增加了TB-EPS中的蛋白质含量。低浓度和高浓度PFAS均显著促进蛋白质分泌，使供体菌增加1.47-2.90倍，受体菌增加1.79-2.67倍。特别重要的是，代表细胞表面疏水性的蛋白质/多糖比率(PN/PS)呈现先升高后降低再升高的复杂变化模式，细胞疏水性也表现出相似趋势。

能量代谢研究发现，低浓度PFBA和PFNA轻微提高细胞内ATP水平，而PFHxA暴露使ATP含量降低0.95倍。在高浓度(2?mg/L)下，PFBA、PFHxA和PFNA的抑制效应更加明显，ATP水平分别降低0.12、0.18和0.23倍。转录组分析揭示，低浓度PFBA上调呼吸复合体编码基因和ATP合酶编码基因，增强ATP生产；而高浓度PFBA则下调NADH脱氢酶和琥珀酸脱氢酶编码基因，抑制泛醌合成。

相关性分析表明，PFAS浓度、ATP含量和SOD活性是影响接合频率的主要因素，相关系数分别为-0.69、0.72和0.63。进一步建立的关系模型显示，ATP含量和SOD活性与接合频率呈线性正相关，而ROS含量和细胞膜通透性则表现出非线性关系。

研究讨论部分深入分析了不同链长PFAS效应差异的机制基础。长链PFNA分子量大、疏水性强，主要通过磷脂双层插层和与膜蛋白结合的方式影响膜通透性，跨膜效率比PFBA低40%-60%，细胞内积累量仅为PFBA的四分之一。而短链PFBA分子量小，主要依靠熵驱动机制，通过被动扩散或通道跨膜，导致细胞内净积累水平更高。高细胞内浓度的PFAS能够直接与生物大分子结合，干扰线粒体质子梯度驱动的ATP合成、细胞分裂和生物膜形成，从而最大程度地影响ARGs接合转移。

研究还发现了代谢途径重塑这一重要的细胞生存策略。在强氧化应激和能量耗竭条件下，细胞采用双重防御策略：一方面分泌多糖/蛋白质以减少PFAS-膜接触；另一方面通过关闭蛋白质通道自主降低膜通透性以限制外源物流入。被阻塞的通道阻碍了跨膜运输和细胞代谢，在此负面情况下，磷/硫代谢的代偿性激活维持了能量生产。

该研究的结论明确指出：低浓度PFAS通过增加细胞膜通透性和ROS含量提高ARGs接合频率；高浓度PFAS则导致严重氧化应激和呼吸链抑制，降低质粒接合频率。本研究首次揭示了不同链长PFAS在压力下对质粒介导的ARGs接合转移频率的差异，这种差异归因于不同链长PFAS进入细胞的不同机制，从而影响细胞膜通透性、细胞内污染物水平以及细胞代谢。PFAS压力可能导致生物体通过调整代谢策略来适应环境，这些代谢策略的变化也可能影响功能基因的转移或造成生物风险。

这项发表在《Environment International》上的研究为深入阐明新兴有机污染物的基因传播风险提供了理论基础。鉴于PFBA和PFHxA在各种水系统中的广泛检测，该发现为未来PFAS替代品的潜在生物风险提供了早期预警，对评估新型污染物的生态环境风险具有重要的科学价值和现实意义。