基于pH循环驱动的小麦谷蛋白-羧甲基纤维素纳米复合物构建及其负载姜黄素乳化性能研究

本研究针对小麦谷蛋白(WPs)溶解性差、应用受限的问题，通过pH循环驱动WPs与羧甲基纤维素(CMC)共组装构建亲水性纳米复合物(WCM)。研究发现CMC可抑制蛋白重折叠，形成结构有序的纳米颗粒，显著提升乳化性能及姜黄素生物可及性(达64.68%)，为疏水性生物活性物质的递送提供了创新解决方案。

　　

在全球追求健康饮食和功能性食品的浪潮中，如何有效递送疏水性生物活性物质一直是食品科学领域的重大挑战。姜黄素作为具有多种健康益处的天然化合物，因其卓越的抗炎和抗氧化特性备受关注，但极低的水溶性和不稳定性严重限制了其应用。与此同时，植物蛋白因其可持续性和营养价值成为研究热点，其中小麦谷蛋白(Wheat gluten proteins, WPs)因其独特的乳化、凝胶和成膜特性而具有巨大潜力。然而，WPs的高比例未带电疏水性氨基酸残基导致其在水性溶剂中溶解度极低，这成为制约其广泛应用的主要瓶颈。

传统方法往往难以有效改善WPs的溶解性，而近年来兴起的pH循环技术为不溶性植物蛋白的结构组装和溶解度提升提供了新思路。这项创新性研究发表于《Food Chemistry: X》，通过pH循环驱动WPs与羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose, CMC)共组装，成功构建了亲水性纳米复合物，并系统评估了其作为纳米载体负载姜黄素的乳化性能和递送能力。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究。首先通过碱提酸沉法从商业小麦谷蛋白中提取纯化WPs，接着使用改良的pH循环方法制备了不同质量比例(10:1、5:1、2:1、1:1、1:2)的WPs-CMC复合纳米颗粒(WCM)。通过动态光散射技术(DLS)分析了颗粒的流体动力学直径(Dh)、多分散指数(PDI)和zeta电位，采用荧光光谱技术研究了内在荧光和外在荧光变化以揭示相互作用机制。利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和X射线衍射(XRD)进行了结构表征，通过原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)观察了表面形态。此外，还系统评估了乳化活性指数(EAI)、乳液稳定性指数(ESI)、絮凝程度和界面蛋白含量，并通过体外模拟胃肠消化模型研究了姜黄素的释放率和生物可及性。

3.1. Particles properties

研究发现，随着pH从12.0调整到7.0，WPs的阳离子区域通过非共价相互作用与CMC的阴离子基团结合，促进了WCM纳米复合物的形成。虽然pH 12改善了WPs在水中的分散性，但中和回中性时仍存在显著沉降。pH循环诱导WPs折叠、自组装和与CMC共组装，形成可分散的WCM纳米颗粒，将蛋白质溶解度从7.92%提高到79.67%。当WPs:CMC比例为5:1时蛋白质溶解度达到峰值，但进一步增加CMC含量会导致下降，可能是由于阴离子多糖基团间的排斥和空间位阻所致。WCM纳米颗粒的平均粒径随WPs:CMC比例降低而增加，特别是WCM 1:1和WCM 1:2超过1000nm。WCM 5:1和WCM 2:1表现出较低的PDI值，表明更大的稳定性和均匀性。WCM纳米颗粒的绝对zeta电位显著低于单独的CMC(38.57mV)，但高于单独的WPs(12.23mV)，证实了WPs和CMC之间的静电相互作用。

3.2. Formation mechanism of WCM

荧光强度分析表明，WPs溶液的荧光强度较低，但随着CMC的添加而增加，在WCM 5:1达到峰值。碱化使蛋白质三级结构展开，将芳香族氨基酸从疏水核心暴露到水环境中。CMC的存在抑制了pH中和过程中蛋白质的重折叠，在共组装过程中保持了蛋白质的未折叠状态。WCM纳米颗粒溶液的光谱出现红移，表明从疏水到亲水蛋白质结构的转变。通过抑制剂实验发现，疏水和静电相互作用是共组装的主要驱动力，而氢键的作用相对较小。

3.3. Structural properties

表面疏水性(Ho)分析显示，随着WPs:CMC比例降低，WCM纳米颗粒溶液的Ho从WPs的1382.83降低到WCM2:1的560.26，表明疏水区域暴露减少，共组装结构的亲水性增强。FTIR光谱显示，WCM纳米颗粒在3250cm^-1附近的峰比WPs更宽化和强化，表明更强的氢键作用。XRD分析显示，与WPs和CMC相比，WCM纳米颗粒呈现出独特的光谱，在7°、20°、28°、32°和45°(2θ)处有峰，表明形成了独特的共组装结构。随着CMC比例增加，WCM纳米颗粒在20°(2θ)处变窄，表明局部有序性增强。

3.4. Surface morphology of WCM nanoparticles

AFM分析表明，WPs表现出典型的蛋白质球形形态，而CMC形成超分子原纤维，组装成不规则的网状结构。随着WPs:CMC比例降低，WCM纳米颗粒的高度相应增加，表明通过共组装形成了更大的颗粒簇。WCM纳米颗粒主要保留了WPs的球形形态，表明蛋白质是主要的结构框架，CMC通过特定的分子间力相互作用。TEM观察进一步证实，WCM 10:1纳米颗粒呈现出松散环状外缘，表明形成了WPs-CMC共组装产生的球形核壳形态。随着WPs:CMC比例降低，WCM纳米颗粒形成了更明显的球形轮廓和增强的结构均匀性。

3.5. Emulsification properties and stability of WCM nanoparticles

乳化特性评估表明，WCM纳米颗粒(16.60–28.93m²/g，59.91min)的EAI和ESI显著高于WPs(8.75m²/g，59.91min)和CMC(6.67m²/g，57.33min)，表明它们在乳液应用中具有潜力。随着WPs:CMC比例降低，WCM乳液的EAI和ESI呈上升趋势，归因于增强的蛋白质溶解度和共组装效果。WCM乳液表现出优于WPs和CMC的抗絮凝能力，源于由静电、疏水、氢键和范德华力稳定的内聚界面层。WCM 2:1乳液在不同温度、pH和盐浓度条件下表现出良好的稳定性，即使在25°C避光储存30天后，Dh为605.05nm(<1000nm)，PDI为0.50。

3.6. Emulsion micromorphology

光学显微镜观察显示，WPs形成的乳液滴小于CMC形成的乳液滴，而WCM乳液(WCM 10:1和WCM 5:1)包含显著更多的滴数。值得注意的是，WCM 2:1乳液表现出更小、均匀分布的滴数，表明在此比例下WPs和CMC之间的强结合增强了复合纳米颗粒与其乳化性能的相容性。激光共聚焦显微镜进一步证实，随着WPs:CMC比例降低，WCM乳液脂滴变得更小且分布更均匀，吸附的界面蛋白逐渐增加。

3.7. Emulsion loading capacity of WCM nanoparticles

负载能力研究表明，WCM纳米颗粒通过高速均质制备乳液，将姜黄素溶解在亚麻籽油中。WPs和CMC的共组装结构提供了疏水空腔和结合位点，促进了疏水姜黄素的封装。保留率随着时间推移而降低，但储存10天后仍保持在70%以上。值得注意的是，保留率随着WPs:CMC比例降低而增加，在比例为2:1时10天后达到84.88%。这种高保留归因于WCM纳米颗粒在油水界面形成致密界面膜，有助于负载和保护姜黄素。

3.8. Digestion and release properties

体外消化研究表明，在胃消化阶段(0–120min)，WCM纳米颗粒乳液中姜黄素的释放率始终低于对照组，表明对活性化合物的降解有有效保护。随着WPs:CMC比例降低，WCM 2:1乳液表现出最明显的保护效果。在肠消化阶段(120–240min)，姜黄素释放速率加快且高于对照组，WCM 2:1乳液表现优异。姜黄素在乳液系统中的生物可及性分别为62.25%(WCM 10:1)、62.70%(WCM 5:1)和64.68%(WCM 2:1)，显著高于对照组(51.69%)(p<0.05)。

本研究通过pH循环改变了WPs的折叠行为，暴露结合位点与CMC相互作用，形成稳定的WCM 2:1纳米颗粒(Dh 832.40nm，PDI 0.38)。CMC在pH从12.0到7.0的中和过程中抑制了蛋白质重折叠，通过与WPs共组装促进亲水构象，从而将其蛋白质溶解度提高到75.34%。疏水和静电相互作用是共组装过程涉及的主要力，形成的WCM纳米颗粒表现出比WPs更强的氢键。形态学研究表明，CMC和WPs之间的适当桥接可以形成致密的纤维网络结构，表现出核壳形态。XRD结果表明，CMC的纤维网络使WCM纳米颗粒的结构更加有序，并适度提高了其结晶度，从而增强了其乳化功能。WCM纳米颗粒表现出优异的乳化性能，CMC成分促进了它们在油水界面的吸附，而WPs的疏水基团在维持乳液稳定性方面发挥了关键作用。这些WCM纳米颗粒乳液有效封装了姜黄素，体外消化研究表明WCM 2:1提高了姜黄素的生物可及性(64.68%)。该研究解决了WPs在乳液中应用的挑战，为蛋白质-多糖相互作用机制提供了新见解，拓宽了它们在功能递送系统中的应用。