基于表面羧基工程与催化活性包涵体交联协同构建结构均一、高稳定性、可回收的β-葡萄糖苷酶聚集体

本研究创新性地提出了一种协同策略，通过蛋白质表面羧基工程与催化活性包涵体（CatIBs）交联技术相结合，成功构建了具有优异热稳定性和可重复使用性的β-葡萄糖苷酶交联酶聚集体（CLEAs）。该研究采用定点突变技术在酶表面引入谷氨酸和天冬氨酸残基，显著增加了可用于交联的表面羧基数量，并通过EDC-NHS介导的聚乙烯亚胺交联制备出形态均一、高活性回收率的CLCatIBs。多点位突变体E7D3 CLCatIBs在80°C处理60分钟后仍保留80%活性，重复使用6次后活性保持率超过75%，在高温纤维二糖水解中葡萄糖转化率较野生型提高1.7倍，为工业级无载体固定化酶的高效制备提供了创新性解决方案。

　　

Highlight

通过理性设计在TsBgl1表面精准引入羧基残基，成功构建了具有增强交联效率的突变体。E7D3 CLCatIBs展现出卓越的热稳定性，在80°C处理60分钟后仍保留80%活性，90°C处理40分钟后保留50%活性。在高温纤维二糖水解中，其葡萄糖转化率较野生型提高1.7倍，重复使用6次后仍保持75%以上初始活性，彰显了其在工业生物催化领域的巨大应用潜力。

Rational Design of TsBgl1

采用EDC-NHS法制备CLEAs过程中，酶表面羧基数量是决定交联效率和结构稳定性的关键因素。本研究通过理性设计策略，在蛋白质表面特定位点引入带有羧基侧链的谷氨酸和天冬氨酸突变，同时最大限度减少对TsBgl1活性和稳定性的潜在影响。基于三级结构分析和表面可及性评估，最终选出13个适合突变的位点，包括第126、196、227、256、258、281、347、382、409、458、465、483和491位残基。这些位点均位于酶分子表面环区或柔性区域，且远离活性中心（距离＞15??），确保突变不会影响催化功能。通过组合突变策略，成功构建了单点（E1）、三点（E3）和七点（E7）突变体，其中E7突变体表面羧基数量较野生型增加约28%。

Conclusion

本研究通过对嗜热耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶TsBgl1进行表面羧基含量调控，成功构建了具有定制化羧基化水平的CatIBs。后续EDC-NHS介导的交联反应产生了具有均匀结构和高活性回收率的CLCatIBs。提高的表面羧基含量显著改善了交联效率和网络致密性，从而增强了热稳定性和可重复使用性。值得注意的是，七点突变体E7D3 CLCatIBs在80°C和90°C下表现出卓越的热稳定性，在重复使用性和高温纤维二糖水解效率方面也显著优于野生型。这种将理性蛋白质设计与包涵体交联固定化相结合的策略，不仅为无载体固定化酶的构建提供了新思路，也为工业生物催化领域提供了具有高活性和优异稳定性的酶制剂设计范例。