电子穿梭介导胞外电子转移促进湖泊反硝化并缓解氧化亚氮排放的新机制

本研究针对富营养化湖泊氮污染与温室气体N2O排放问题，通过野外调查与实验室15N同位素实验，揭示了腐殖质(HS)介导的电子穿梭通过激活细菌外膜c型细胞色素(omcB)显著增强反硝化过程，并特异性富集nosZII型还原菌降低N2O排放。该研究阐明了EET耦合反硝化的微生物机制，为湖泊氮循环调控和温室气体减排提供了理论依据。

　　

随着全球氮输入量的持续增加，水体富营养化已成为严峻的环境问题。湖泊作为重要的生态系统，其沉积物中的氮去除过程对维持水质至关重要。反硝化作为主要的生物脱氮途径，能够将硝酸盐转化为氮气，永久性地从生态系统中去除生物可利用氮。然而，这一过程常常因电子供体不足而受到限制，导致反硝化效率低下，并伴随产生强效温室气体氧化亚氮(N₂O)——其全球变暖潜能值是二氧化碳的310倍。

在氧化还原条件剧烈波动的沉积物环境中，胞外电子转移(EET)过程为微生物代谢提供了关键支持。其中，腐殖质(HS)作为最丰富的天然电子穿梭体，占水体、土壤和沉积物中天然有机质的50%-80%。这些来源于植物和微生物残体分解的有机聚合物，虽然已知能够支持EET过程，但其如何具体影响反硝化速率以及微生物耦合机制，至今仍不清楚。

为了解决这一科学问题，中国科学院水生生物研究所的宋康研究员团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员通过综合运用质谱分析、X射线光电子能谱(XPS)、水化学分析、生物电化学技术和分子生物学方法，系统探究了EET耦合反硝化过程的微生物机制。

研究主要采用了以下关键技术方法：在太湖流域12个采样点进行野外调查，采集沉积物和上覆水样；通过微生物燃料电池(MFC)测定沉积物最大功率密度(MPD)评估电子传递能力；利用¹⁵N同位素标记技术量化反硝化速率；结合宏基因组分箱技术解析微生物代谢途径；采用实时定量PCR分析功能基因表达。

Characteristics of HS determine electron transfer capacity in sediment

研究发现溶解性HS浓度在9.5-201.0 mg g^-1沉积物范围内变化，其中腐殖酸(HA)占总溶解性HS的92.8±9.4%。通过微生物燃料电池测定的最大功率密度(MPD)与HS浓度呈显著正相关(R²=0.7355, p=0.0004)，表明天然电子穿梭体能够显著增强电子传递能力。XPS分析进一步揭示，随着MPD增加，HA和FA中与电子交换相关的官能团(C-OH和C=O)原子百分比增加，这些官能团分别贡献电子给予能力(EDC)和电子接受能力(EAC)。

Enhanced electron transfer capacity improves lake denitrification performance while reduces N₂O emissions

MPD与溶解N₂和ΔN₂浓度呈最强正相关性(R²≥0.7926)，是驱动N₂排放的关键环境因子。更重要的是，MPD与所有测量的N₂O排放特征均呈负相关，特别是与N₂O/(N₂O+N₂)比值(p<0.05)。这表明EET提供的额外电子供应促进了完全反硝化，特别增强了沉积物中的N₂O还原过程。

Electron transfer-related functional groups of HS

通过比较低、中、高MPD沉积物样本，发现高MPD样本中HA和FA的C-OH和C=O官能团总原子百分比显著增加。这些官能团是决定HS电子交换能力的关键，其中酚型C-OH基团主要贡献电子给予能力，而醌型C=O基团支持电子接受能力。

Key EET processes affecting denitrification and N₂O emissions

所有EET功能基因(omcB、omcS、pilA)均与反硝化功能基因(nirS和nirK)呈显著正相关。特别值得注意的是，只有omcB基因与溶解N₂和ΔN₂浓度呈显著正相关(R²≥0.6988)，并且与HA和FA浓度也表现出强正相关性(R²≥0.5205, p<0.05)。在沉积物中添加HS后，omcB基因的表达水平比空白组提高了31.5倍，远高于omcS(2.0倍)和pilA(3.3倍)基因的增加幅度。

关于N₂O还原，研究发现所有EET功能基因均与nosZII基因呈显著正相关(R²≥0.5204, p<0.05)，而只有pilA基因与nosZI基因显著相关。添加HS后，nosZII基因的相对表达比(31.5倍)比nosZI基因(7.7倍)高4.1倍，表明EET主要通过富集nosZII型N₂O还原菌来降低N₂O排放。

HS addition enhanced EET and complete denitrification processes in sediment

通过添加外源HS的实验验证，HS添加组(HS_C)的MPD显著升高(p=0.0025)。¹⁵N同位素标记证实反硝化(71.1±31.1%)是N₂产生的主要途径，HS添加使反硝化速率提高了2.6倍(p=0.0028)。经过24小时培养后，HS添加降低了累积N₂O水平达41.3%-98.8%。

值得注意的是，在测试的HS浓度范围(0-230 mg-HS g^-1沉积物)内，反硝化速率的增强比(HS_C/Blank)随着原生HS浓度的增加呈指数下降(R²=0.6899)。低MPD样本在添加HS后MPD增加了34.1倍，显著高于所有样本的2.0倍增加量。外源电子穿梭体添加的效果在原生HS浓度超过50 mg-HS g^-1的沉积物中显著减弱。

Microbial community composition variation with MPD

微生物群落分析显示，放线菌门(Actinobacteriota)、盐杆菌门(Halobacterota)、绿弯菌门(Chlorobiota)和拟杆菌门(Bacteroidota)是主要的优势门。在高MPD沉积物中，拟杆菌门更为丰富。优势微生物包括电活性产甲烷菌(Methanosaeta、Methanosarcina、Methanolinea)和反硝化细菌黄杆菌(Flavobacterium)。在物种水平，高MPD沉积物中电活性铁还原菌Ferribacterium limneticum、氢营养型反硝化菌Quatrionicoccus australiensis和异养反硝化菌Acinetobacter sp. CS-2的丰度增加。

Mechanisms of EET in facilitating denitrification in lakes

研究通过宏基因组分箱获得了41个中等质量(完整度≥50%，污染度<10%)和高质量(完整度>90%，污染度<5%)的宏基因组组装基因组(MAGs)。研究发现EET细菌通过内源电子穿梭体(即黄素)直接或间接地将电子转移给HS。具体而言，FmnA和FmnB蛋白负责分泌内源黄素穿梭体，而DmkA和DmkB合成脱甲基萘醌(DMK)衍生物——这是EET链中的关键组分。II型NADH脱氢酶(Ndh2)将电子从NAD转移到DMK，随后通过EetA和EetB蛋白将这些电子转移到游离黄素穿梭体，这些黄素再将电子转移到细胞外电子穿梭体(如HS)。

研究发现MAG LXG.52拥有基于黄素的EET完整基因集，而MAG DX.27缺乏FmnA合成所需基因。因此，LXG.52可能通过黄素间接传递电子，而DX.27直接将电子传递给HS。有趣的是，LXG.52和DX.27都不直接参与反硝化过程。进一步分析表明，MAG LXG.52(Anaerovoracaceae科)通过异养糖酵解途径提供电子，而MAG DX.27(Thermodesulfovibrionales目)利用自养异化硫还原途径。

在41个MAGs中，有19个与反硝化相关，但每个MAG仅包含介导一个或两个还原步骤的基因。因此，在特定的MAGs和反硝化菌Quatrionicoccus australiensis中，由于缺乏亚硝酸盐还原基因，亚硝酸盐可能成为终端反硝化产物。这与沉积物亚硝酸盐浓度与MPD和腐殖质浓度呈显著正相关的结果一致。

值得注意的是，这些与反硝化相关的MAGs都没有完全发育的EET能力，但有些表现出了摄取细胞外电子的能力。例如，MAGs DX.24(Dissulfurispiraceae科)和DX.76(Burkholderiaceau科)可以通过含血红素的周质膜结合细胞色素(HPMC)摄取细胞外电子。这些电子随后被转移到周质可溶性细胞色素(PSC)或复合物稳定细胞色素(CSC)，这一电子转移过程增强了有氧(napA和napB)和厌氧(narG和narH)的NO₃还原途径。

同样，LXG.32含有用于NO₂还原的octR，也具有HPMC、PSC和CSC合成能力。此外，通过HPMC和PSC，LXG.39促进了norB介导的NO还原，而LXG.62和LXG.70促进了nosZ介导的N₂O还原。值得注意的是，MAGs LXG.62和LXG.70被归类为nosZII型N₂O还原菌。与nosZI型反硝化菌相比，nosZII型反硝化菌可以利用更低浓度的N₂O，这可以解释在高MPD采样点观察到的较低N₂O排放。

研究最终提出了一个概念模型，阐明HS衍生的电子穿梭如何调节湖泊中的氮生物地球化学循环。氧化还原反应的实质是电子转移，然而电子穿梭介导的外部电子供应对沉积物反硝化和N₂O还原的贡献一直被忽视。本研究证明HS介导的EET(主要由omcB调节)显著增强了湖泊中的生物脱氮，有助于缓解富营养化。此外，这种电子穿梭过程促进了N₂O还原(主要由nosZII调节)，减轻了人为引起的全球变暖。

鉴于HS电子穿梭体在沉积物、土壤和永久冻土中的溶解有机质等自然环境中的广泛存在，了解细胞外和细胞内电子对地球生物地球化学循环的全球尺度贡献以及它们对全球变化的响应需要进一步研究。由于HS添加的氮去除增强效果随着沉积物中原生HS浓度的增加而减弱，环境管理应优先在原生HS水平低的污染水生系统中应用电子穿梭体修正，以最大化成本效益。

该研究不仅揭示了EET耦合反硝化的微生物机制，还为湖泊氮污染治理和温室气体减排提供了重要的理论依据和实践指导。通过电子穿梭体的调控，可以有效增强湖泊沉积物的自净能力，同时减少强效温室气体N₂O的排放，对于应对全球气候变化和维护水生态系统健康具有双重意义。