NAT10介导的ac4C修饰通过稳定HMOX1加剧深静脉血栓形成中的铁死亡

《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》：NAT10-Mediated ac4C-Modification Exacerbates Ferroptosis by Stabilizing HMOX1 in Deep Vein Thrombosis

本研究揭示了NAT10（N-乙酰转移酶10）介导的N4-乙酰胞苷（ac4C）RNA修饰是驱动内皮细胞铁死亡（ferroptosis）并加剧深静脉血栓（DVT）发病的关键表观遗传机制。通过构建内皮细胞特异性NAT10基因敲除小鼠模型，结合acRIP-seq、蛋白质组学等多组学技术，发现NAT10通过催化HMOX1（血红素加氧酶1）mRNA的ac4C修饰增强其稳定性，导致Fe2+蓄积和脂质过氧化，从而促进血栓形成。研究首次阐明NAT10-HMOX1调控轴在DVT中的作用，为靶向NAT10抑制铁死亡提供了新的治疗策略。

　　

Abstract

背景：深静脉血栓形成（DVT）是一种常见的外周血管疾病，与内皮细胞异常表观遗传过程和基因表达改变密切相关。近年研究发现NAT10介导的N4-乙酰胞苷（ac4C）修饰在铁死亡中发挥独特作用，但其在DVT中的具体机制尚不明确。

方法：通过构建内皮细胞特异性GPX4和NAT10基因敲除小鼠模型，结合RNA免疫共沉淀（RIP）、ac4C RIP-qPCR、N4-乙酰胞苷点印迹和蛋白质印迹等技术进行分子机制解析。

结果：GPX4是抑制铁死亡的关键基因。利用内皮细胞特异性GPX4条件性敲除小鼠（GPX4^fl/flCdh5-Cre⁺）证实内皮细胞铁死亡促进血栓形成。NAT10在DVT小鼠中表达升高，沉默NAT10可显著抑制体内外铁死亡。机制研究表明，NAT10通过ac4C修饰增强HMOX1 mRNA稳定性，导致Fe²⁺蓄积和脂质过氧化。

结论：NAT10下调通过调控HMOX1表达减轻内皮铁死亡，从而抑制DVT发生发展。

临床意义

本研究首次揭示NAT10介导的ac4C修饰通过稳定HMOX1 mRNA促进铁死亡，成为DVT的新型治疗靶点。内皮特异性敲除NAT10或使用抑制剂Remodelin可显著减轻血栓负荷，而HMOX1过表达能逆转NAT10缺失的保护效应，确立HMOX1为下游关键效应分子。

引言

DVT年发病率超过1/1000，其发生与内皮损伤、静脉淤滞和高凝状态密切相关。铁稳态失衡与血栓形成关联性逐渐被揭示，铁蓄积通过Fenton反应加剧氧化应激，促进铁死亡。ac4C作为新型mRNA修饰，由唯一已知的写入酶NAT10催化，参与细胞衰老、自噬和铁死亡等过程。HMOX1作为铁死亡激活剂，分解血红素产生Fe²⁺，但其在DVT中的作用尚未明确。

材料与方法

采用4D标记自由蛋白质组学（数据集PXD067933）和acRIP-seq（GSE307103）分析DVT患者和小鼠模型样本。通过内皮细胞特异性敲除小鼠（NAT10^fl/flCdh5-Cre^ERT2和GPX4^fl/flCdh5-Cre^ERT2）及抑制剂（Remodelin、Fer-1、ZnPP）干预，评估血栓形成和铁死亡指标。检测指标包括Fe²⁺含量、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、脂质过氧化等。

结果

铁死亡抑制 ameliorates DVT形成

KEGG富集分析显示铁死亡通路在DVT中显著激活（图1A-B）。单细胞RNA测序证实内皮细胞铁死亡特异性富集（图1C-D）。电镜观察发现DVT小鼠血管内皮线粒体皱缩、嵴减少（图1E）。DVT组Fe²⁺和MDA水平显著升高（图1F-G），GSH降低（图1H）。Fer-1干预后血栓尺寸缩小，内皮功能改善（图1I-N）。GPX4敲除小鼠血栓形成加剧（图S1），证实铁死亡在DVT中的关键作用。

NAT10介导的铁死亡加剧血栓形成

点印迹显示DVT小鼠血管内皮ac4C修饰水平升高（图2A），NAT10表达上调（图2B-D）。Remodelin干预和内皮特异性NAT10敲除（图S3）均显著减轻血栓负荷（图2E-H）和铁死亡指标（图2I-K）。

NAT10下调增强体外铁死亡抵抗

Ang II诱导的内皮功能障碍模型中NAT10和HMOX1表达升高（图S11）。RSL3和FINO2处理增加NAT10蛋白水平（图S4D），而Fer-1逆转此效应（图S11E-F）。NAT10抑制显著改善细胞活力（图3A；图S4A-C，S5A-B），逆转铁死亡形态变化（图3B），降低脂质过氧化和Fe²⁺水平（图3C-F；图S5D-E），调节MDA/GSH平衡（图3G-H；图S5C）。

NAT10通过ac4C修饰稳定HMOX1

acRIP-seq鉴定出ac4C修饰特征 motif CXXCXXCXX（图4A）。联合分析筛选出HMOX1为关键靶基因（图4B），其在DVT中显著上调（图4C-D）。NAT10敲低降低HMOX1 mRNA和蛋白水平（图4E-F；图S7，S10A-B），acRIP-qPCR证实ac4C修饰减少（图4G），RIP-qPCR验证NAT10与HMOX1 mRNA结合（图4H）。放线菌素D实验显示NAT10抑制加速HMOX1 mRNA降解（图4I）。功能实验表明NAT10-HMOX1轴调控铁死亡相关分子（图4J-O；图S8）。

NAT10通过抑制HMOX1恢复内皮功能

ZnPP抑制HMOX1减轻血栓形成（图5A-G）。CoPP诱导HMOX1过表达加剧铁死亡（图5H-K；图S9B）。NAT10敲低逆转HMOX1过表达引起的GPX4下降和氧化应激（图5I-J，L-M；图S10C-F）。

NAT10通过调控HMOX1减轻DVT形成

体内实验证实NAT10敲除小鼠血栓减小（图6A-D），铁死亡指标改善（图6E-H；图S12），内皮功能标志物（ET-1、TNF-α、eNOS、TGF-β1）恢复正常（图6J-M；图S12A）。AAV介导的HMOX1过表达逆转NAT10缺失的保护效应（图S12B-F）。

讨论

本研究首次阐明NAT10-ac4C-HMOX1轴在DVT相关铁死亡中的核心地位。NAT10通过增强HMOX1 mRNA稳定性促进Fe²⁺释放和脂质过氧化，形成正反馈循环。内皮特异性NAT10敲除和药理学抑制均显著改善血栓形成，为DVT治疗提供新靶点。值得注意的是，NAT10在铁死亡中的调控作用存在组织特异性，本研究聚焦血管内皮领域取得突破性进展。

创新性与局限性

研究创新性在于揭示ac4C修饰在血栓疾病中的新功能，建立NAT10-HMOX1调控轴与铁死亡的直接联系。局限性在于未探讨其他ac4C读取蛋白的作用，且临床转化需进一步验证。

结论

NAT10驱动的ac4C修饰通过稳定HMOX1 mRNA加剧内皮铁死亡，促进DVT发展。靶向NAT10-HMOX1轴可能成为抑制血栓形成的新策略。