《Journal of the American Heart Association》：Unveiling the Impact of Porphyromonas gingivalis‐Associated Periodontitis on Stroke Outcome in Mice
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本研究首次通过动物实验证实牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）相关的牙周炎会通过双重机制（系统性炎症加剧和血脑屏障破坏）显著恶化缺血性脑卒中（tMCAO模型）结局。研究发现牙周炎可导致脑梗死体积扩大、运动功能缺损加重，并揭示其作用机制与牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶（gingipains）直接损伤内皮细胞紧密连接蛋白（ZO-1、occludin）密切相关。该研究为牙周炎作为可干预的脑卒中风险因素提供了实验依据。
Abstract
牙周炎是一种感染源性的慢性炎症性疾病，主要影响牙齿支持组织。越来越多的流行病学证据表明，牙周炎是缺血性脑卒中的危险因素，并与不良预后相关。然而，这种关联的潜在机制尚未完全阐明。
背景
尽管有广泛的预防措施、可用疗法以及传统风险因素（如主动吸烟、高血压、血脂异常和糖尿病）的管理，脑卒中仍然是神经功能障碍的主要原因，并显著影响全球死亡率。脑卒中对身心健康具有深远的长期影响。缺血性脑卒中的高患病率提示了常被忽视的合并症的作用，包括传染病和口腔健康状况。其中，牙周炎是最常见的口腔疾病之一。牙周炎的特点是口腔菌群失调，导致牙龈炎症和牙齿支持组织的不可逆破坏，最终导致牙齿脱落。重要的是，牙周炎被认为是多种疾病的独立风险因素，包括类风湿性关节炎、神经退行性疾病、心血管疾病，尤其是缺血性脑卒中。流行病学研究一致强调了牙周炎与缺血性脑卒中之间的关联。然而，尽管确定了牙周炎与脑卒中之间的关联，但其在缺血性脑卒中病理生理学中的具体作用机制仍然知之甚少，临床前研究存在空白，未能完全阐明牙龈卟啉单胞菌的间接和直接作用。
方法
本研究采用C57BL/6J小鼠模型，在存在或不存在结扎诱导的牙周炎（使用牙龈卟啉单胞菌浸泡的结扎线）的情况下，通过短暂阻塞大脑中动脉诱导缺血性脑卒中。通过梗死体积、感觉运动缺陷、血脑屏障完整性和全身及脑炎症标志物评估脑卒中严重程度。在体外进一步探讨了牙龈卟啉单胞菌对血脑屏障内皮细胞的直接影响。
结果
与假手术组相比，患有牙龈卟啉单胞菌相关性牙周炎的小鼠脑卒中严重程度显著加剧：梗死体积更大、感觉运动缺陷更严重、血脑屏障破坏更严重、脑中性粒细胞浸润增加。全身炎症也显著升高。在暂时性大脑中动脉闭塞前，单独静脉注射牙龈卟啉单胞菌（无牙龈损伤）足以放大脑炎症和脑卒中病变。在体外，牙龈卟啉单胞菌通过其牙龈蛋白酶，通过增加内皮通透性和破坏紧密连接蛋白直接损害血脑屏障完整性。
Impact of P gingivalis‐Associated Periodontitis on Infarct Volume, BBB Rupture, and Stroke Outcome
在第一组实验中，研究了牙周炎对脑卒中结局的影响。在诱导牙周炎15天后，对小鼠进行1小时的tMCAO手术以诱导脑卒中。在脑卒中急性期（脑卒中后2天）处死小鼠以研究脑炎症和组织重塑，或在较晚时间点（脑卒中后7天）处死以研究感觉运动缺陷。结果显示，与对照组相比，LIP-Pg组小鼠表现出加重的感觉运动缺陷、显著增大的脑卒中体积、增加的脑水肿以及更严重的血脑屏障破坏（通过IgG外渗评估）。
LIP‐Pg‐Induced Systemic Inflammation
在脑卒中诱导时，通过评估牙槽骨吸收来确定牙周炎的存在。高分辨率微型计算机断层扫描用于测量牙槽骨嵴与釉质牙骨质界之间的距离。在假手术组小鼠中，基线和脑卒中诱导前一天之间未观察到显著差异，而在接受牙龈卟啉单胞菌接种的结扎线处理的小鼠（LIP-Pg组）中，观察到脑卒中诱导前一天与基线相比骨吸收显著增加。此外，在LIP-Pg小鼠的血浆中检测到脂多糖，表明细菌进入血流。LIP-Pg小鼠还表现出全身性炎症，证据是循环中性粒细胞和单核细胞显著增加，以及促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α浓度升高。这些小鼠还表现出显著更高的血浆CXCL1、ICAM-1和VCAM-1水平，进一步支持牙周炎通过促进炎症细胞募集和血管粘附来增强全身炎症的观点。
Periodontitis Provoked Worse Stroke Outcome
通过评估脑卒中诱导前以及tMCAO后第1、2和7天的感觉运动缺陷严重程度，评估了牙龈卟啉单胞菌诱导的牙周炎对脑卒中结局的影响。LIP-Pg小鼠表现出加重的感觉运动缺陷。假手术组小鼠在脑卒中后第1天神经评分显著下降，但在第16天（评分：19/38）和第21天（评分：25/38）之间显示出感觉运动功能恢复的趋势，而LIP-Pg小鼠在脑卒中诱导后的7天内保持显著较低且稳定的神经评分。
LIP‐Pg Increased Stroke Size and Potentiated BBB Disruption
tMCAO后7天测量脑卒中大小，显示LIP-Pg小鼠的脑卒中体积显著大于假手术组小鼠。此外，LIP-Pg小鼠表现出增加的脑水肿。tMCAO后的血脑屏障完整性通过IgG外渗测量进行评估。两组小鼠均显示血浆IgG大量流入同侧半球，但LIP-Pg小鼠的差异更为明显。重要的是，在对侧半球内的IgG浓度接近检测限，两组小鼠之间没有差异。此外，接受tMCAO假手术的LIP-Pg和对照组小鼠未显示任何梗死区域，也未显示IgG外渗，表明没有血脑屏障破坏。
LIP‐Pg Exacerbated Inflammation and Brain Leukocyte Infiltration in Stroke Mice
如前所述，LIP-Pg小鼠表现出全身炎症反应。tMCAO后，在脑卒中后48小时观察到循环中性粒细胞和单核细胞计数升高，以及IL-1β、IL-6和TNF-α浓度增加。使用流式细胞术对大脑半球细胞悬液进行监测，发现脑卒中后48小时，LIP-Pg小鼠同侧半球的中性粒细胞和单核细胞浸润高于假手术组。相反，两组小鼠的对侧半球均检测到少量中性粒细胞和单核细胞。此外，通过定量髓过氧化物酶浓度，证实了中性粒细胞在缺血脑组织中的积累和活化。观察到患有牙龈卟啉单胞菌相关性牙周炎的小鼠缺血脑组织中的髓过氧化物酶显著增加。此外，在LIP-Pg脑卒中小鼠的同侧半球检测到编码牙龈卟啉单胞菌16S rRNA的DNA，而对侧半球未发现，表明牙龈卟啉单胞菌仅能浸润受伤的半球。
Role of P gingivalis Bacteremia on Stroke
为了测试牙龈卟啉单胞菌直接促进脑卒中病理生理学的假设，在诱导tMCAO脑卒中前静脉注射牙龈卟啉单胞菌或生理盐水。注射牙龈卟啉单胞菌的小鼠表现出显著升高的脂多糖循环水平。全身给予牙龈卟啉单胞菌对脑卒中严重程度有直接影响。注射牙龈卟啉单胞菌的小鼠通过氯化三苯基四氮唑染色检测到的坏死区域体积显著增加。此外，通过IgG染色评估的血脑屏障破坏和通过Ly6G染色评估的中性粒细胞积累在牙龈卟啉单胞菌给药后的缺血大脑半球显著增强。
Role of P gingivalis on BBB Disruption
由于LIP-Pg实验模型和牙龈卟啉单胞菌的全身给药均引发了血脑屏障破坏，因此旨在研究牙龈卟啉单胞菌与血脑屏障之间的相互作用，使用hCMEC/D3细胞作为体外模型。在正常氧条件下进行的实验表明，牙龈卟啉单胞菌能够以剂量依赖性方式破坏血脑屏障功能。鉴于PECAM-1在维持血脑屏障完整性中的关键作用及其对蛋白酶活性的敏感性，研究了牙龈卟啉单胞菌蛋白酶是否可以通过诱导PECAM-1胞外域的蛋白水解脱落来破坏血脑屏障。观察到由于刺激4小时后APC荧光降低，MFI比率显著降低，表明牙龈卟啉单胞菌能够诱导PECAM-1胞外域的脱落。为了进一步研究牙龈卟啉单胞菌破坏血脑屏障的机制，使用靶向Arg-和Lys-牙龈蛋白酶的药理抑制剂KYT-41或使用缺乏两种牙龈蛋白酶表达的牙龈卟啉单胞菌突变株（KDP136）处理D3细胞。与野生型牙龈卟啉单胞菌菌株相比，用KYT抑制剂预处理牙龈卟啉单胞菌10分钟或用KDP牙龈卟啉单胞菌菌株刺激不会导致阻抗显著降低。PECAM-1的流式细胞术分析显示，与野生型牙龈卟啉单胞菌相比，用KDP菌株或KYT抑制剂刺激的细胞PECAM-1脱落显著减少。这些发现强烈表明牙龈蛋白酶在牙龈卟啉单胞菌破坏血脑屏障中起关键作用。
Impact of P gingivalis on hCMEC/D3 Permeability and Cell Junctions Under Stroke Conditions
为了模拟脑卒中中的脑缺血/再灌注，诱导缺氧缺糖4小时，然后进行4小时的再灌注期。用牙龈卟啉单胞菌预处理hCMEC/D3细胞加剧了OGD/R对血脑屏障破坏和旁细胞屏障功能的影响。具体而言，牙龈卟啉单胞菌预刺激加剧了缺血/再灌注对阻抗的影响，并加剧了通过测量孔板基底外侧室中葡聚糖-FITC荧光来评估的大分子旁细胞转运。为了更深入地了解观察结果背后的分子机制，检测了PECAM-1、occludin和ZO-1的表达水平。在正常氧和葡萄糖条件下，用牙龈卟啉单胞菌刺激hCMEC/D3细胞显著降低了PECAM-1、ZO-1和occludin的表达。此外，虽然OGD/R对连接蛋白仅有轻微影响，但牙龈卟啉单胞菌显著增强了OGD/R的影响。
讨论
本综合系列实验深入探讨了预先存在的牙龈卟啉单胞菌相关性牙周炎与小鼠脑卒中之间的复杂关系。通过使用可靠的实验模型，揭示了牙周炎对脑卒中病变和结局的有害影响的有力证据。据我们所知，我们的研究结果首次证明，与接受脑卒中但无牙周炎的假手术小鼠相比，接受牙龈卟啉单胞菌浸泡牙齿结扎线诱导牙周炎的小鼠在tMCAO后表现出显著更大的脑卒中体积、增加的脑水肿和更严重的感觉运动缺陷。这些结果突出了牙周炎在加剧脑卒中严重程度中的病理作用。牙周炎是一种炎症性疾病，与全身炎症和合并症（包括缺血性脑卒中）密切相关。本研究报道LIP-Pg小鼠表现出全身炎症，证据是血浆中促炎细胞因子（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）浓度增加，这些是脑卒中期间急性脑损伤的重要介质。此外，观察到LIP-Pg小鼠循环中性粒细胞和单核细胞计数升高。中性粒细胞和单核细胞是缺血性脑卒中后的第一道防线，在缺血后24至48小时浸润大脑，参与脑损伤。大量中性粒细胞的存在与脑卒中严重程度密切相关，并且中性粒细胞耗竭已被证明具有保护作用。本研究发现，与接受tMCAO但无牙周炎的小鼠相比，LIP-Pg相关性牙周炎在缺血病变边界引发了大量中性粒细胞和单核细胞流入。趋化因子CXCL1（在吸引中性粒细胞到炎症部位起关键作用）和粘附分子ICAM和VCAM（促进免疫细胞跨血脑屏障迁移）的增加，突出了牙周炎可能加剧脑卒中后中性粒细胞浸润的潜在机制。迁移到缺血区域后，中性粒细胞和单核细胞被激活并释放几种介质，如髓过氧化物酶，这些介质有助于加重大脑损伤，特别是通过产生活性氧来促进细胞凋亡。除了全身炎症，牙周炎还可能通过牙周细菌（包括牙龈卟啉单胞菌）及其副产物在血液中传播，并通过到达远程组织（包括动脉粥样硬化斑块和脑卒中患者的血栓）在合并症中发挥作用。尽管在我们的实验条件下未发现存活的循环牙龈卟啉单胞菌，但我们在血液中检测到脂多糖，更重要的是，我们还在LIP-Pg小鼠的同侧（有脑卒中）半球内检测到编码牙龈卟啉单胞菌16S RNA的DNA。重要的是，我们未观察到接受牙周炎和tMCAO假手术的小鼠有任何脑损伤，如TTC染色和血脑屏障破坏（通过IgG外渗评估）所示。这些发现有力地表明，在LIP-Pg+tMCAO小鼠中观察到的加剧的脑损伤不是由牙龈卟啉单胞菌的直接炎症作用或脑感染引起的，而是牙周炎和缺血/再灌注损伤协同作用的结果。我们还使用了一种补充方法，即在脑卒中诱导时通过受控静脉注射给予牙龈卟啉单胞菌。静脉注射模型旨在专门解决局部牙周疾病与急性细菌传播的相对贡献。该实验模拟了在常规口腔活动或牙科手术期间发生的短暂菌血症事件。它还可以精确控制菌血症的剂量和时间，同时将牙龈卟啉单胞菌的全身效应与结扎线引起的局部牙周炎症的混杂影响隔离开来。重要的是，我们证明两种模型实现了相当的全身细菌负荷，如血浆脂多糖水平所示，证实了静脉注射在模拟与慢性牙周炎相关的细菌传播方面的相关性。使用该模型，我们证实牙龈卟啉单胞菌菌血症本身足以加剧脑卒中损伤、破坏血脑屏障并促进中性粒细胞浸润。我们进一步阐明了连接牙周炎和脑卒中的潜在机制，揭示了血脑屏障完整性破坏。LIP-Pg小鼠在同侧半球表现出IgG外渗，表明牙龈卟啉单胞菌可能加剧血脑屏障破坏。为了进一步研究牙龈卟啉单胞菌对血脑屏障的细胞和分子机制，我们使用了hCMEC/D3细胞，这些细胞经受缺血/再灌注（缺氧缺糖后恢复正常氧和葡萄糖条件）。我们发现，用牙龈卟啉单胞菌刺激的OGD/R细胞表现出高度受损的血脑屏障功能，特别是细胞渗漏，允许大分子旁细胞转运，这可能是由于PECAM-1和紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达减少所致。牙龈卟啉单胞菌拥有许多毒力因子，使其能够逃避免疫系统并引发炎症反应和组织损伤。在这些因子中，牙龈蛋白酶是牙龈卟啉单胞菌毒性的关键介质，已被证明可降解各种宿主蛋白，包括胶原蛋白、纤维蛋白原和免疫球蛋白，并可调节炎症和免疫反应。为了确定牙龈蛋白酶对血脑屏障破坏的作用，我们使用了牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶缺陷突变体和药理抑制剂。我们的结果表明，抑制牙龈蛋白酶可保护血脑屏障的完整性，特别是通过作用于连接蛋白。因此，使用我们预先存在牙龈卟啉单胞菌牙周炎的脑卒中实验模型，在体内评估牙龈蛋白酶抑制剂的功效将是有趣的。在这方面，Dominy等人先前观察到赖氨酸-牙龈蛋白酶抑制剂COR可减少老年小鼠的大脑牙龈卟啉单胞菌感染并限制神经退行性变。即使牙龈卟啉单胞菌是一种重要的牙周病原体，单一感染实验模型并不能紧密反映人类牙周炎，后者涉及广泛的牙周病原体和口腔菌群失调。因此，我们建议为未来的研究开发小鼠牙周炎的多种微生物模型，特别纳入组成红色复合体的牙周细菌，以阐明主要牙周细菌与脑卒中之间的复杂相互作用。此外，仅限于雄性小鼠是一个局限性。尽管有流行病学模式支持，但在未来研究中纳入两性对于提高我们研究结果的转化相关性和普适性至关重要。总之，这项研究首次直接证明了牙周炎对小鼠脑卒中的影响，强调了在脑卒中研究和临床管理中考虑牙周炎的重要性。我们的研究提供了机制性见解，说明牙周炎，特别是当与牙龈卟啉单胞菌相关时，如何可能恶化脑卒中结局。这里提出的研究为未来的研究和潜在的临床应用开辟了几个重要的视角。了解牙周炎与脑卒中之间的关系可能为预防措施铺平道路，包括改善缺血性脑卒中患者的牙周炎诊断，鼓励设立干预性临床试验以评估牙周治疗对缺血性脑卒中结局的益处，最终为脑卒中患者提出个性化干预措施，从而减轻脑卒中的健康和经济负担。
