《Journal of Advanced Research》：Genomic mechanism of aroma terpenoids biosynthesis in plants
编辑推荐：
这篇综述系统阐述了全基因组数据在解析植物芳香萜类生物合成机制中的核心作用，重点探讨了萜类合酶（TPS）的起源、进化与工程化前景，为植物育种和工业化生产适应性提升提供了新视角。文章从TPS基因家族的全基因组鉴定与系统发育分析、TPS功能与结构基础、以及TPS基因起源模式三个维度，深入剖析了亲缘关系远近不同的物种合成相同芳香萜类化合物的基因组机制。
基因组水平鉴定与TPS系统发育分析
芳香植物基因组的组装、特征与进化
随着第三代测序技术的发展，芳香植物的基因组组装进入了新时代。许多具有重要经济价值的芳香物种现已发布了高质量基因组。这些基因组资源揭示了塑造TPS基因进化的多个特征。基因簇，定义为功能相关基因的紧密物理聚集，通常通过基因复制或参与同一代谢途径的基因共定位而产生。研究人员在葡萄（Vitis vinifera）中鉴定了一个包含45个TPS基因的簇，这可能与挥发性化合物的多样性有关。胡萝卜（Daucus carota）中也报道了一个包含5个TPS基因的基因簇，这些基因编码负责芳樟醇和香叶醇等单萜生物合成的酶。植物基因组中常见的基因对包含TPS，其中TPS-细胞色素P450（CYP）基因对尤为普遍。这样的TPS-CYP基因对已在狭叶薰衣草（Lavandula angustifolia）、温郁金（Curcuma wenyujin）等芳香植物中被鉴定，促进了多种芳香萜类化合物的生物合成。TPS基因的结构变异也影响挥发性成分的组成和丰度。研究证明，在互叶白千层（Melalleuca alternifolia）一个含有10个TPS基因的基因组区域存在结构变异，这可能导致了该物种内不同个体间VOCs的多样性。此外，转座因子（TE）介导的基因重组被认为是一种促进TPS相关基因簇形成的机制，从而增强了植物的花香多样性。
作为萜类合成的关键基因，TPS基因家族已在许多芳香植物中得到鉴定。研究发现，已有51种植物进行了TPS基因的全基因组鉴定，其中43种植物拥有染色体水平的基因组。基因家族扩张为TPS基因的功能分化提供了原材料，而正向选择是基因进化的驱动力。正向选择是自然选择对有利变异的定向保留，表现为基因序列中非同义突变率（Ka）高于同义突变率（Ks）。它可以促进基因的功能分化和新功能化。功能特异性的TPS被认为是在被正向选择捕获后，从具有混杂功能的TPS进化而来。研究发现，来自蔷薇科的毛叶番荔枝（M. domestica）、月季花（Rosa chinensis）和野草莓（Fragaria vesca）中的10个TPS基因是在正向选择下进化的。此外，研究证明正向选择驱动了水稻(E)-β-石竹烯合酶基因OryzaTPS1直系同源基因的功能分化。他们进一步提出，稻属（Oryza）物种中产生分化的倍半萜是吸引植食性昆虫天敌的一种适应性进化策略。
基于34种植物基因组的TPS鉴定与系统发育分析
全基因组数据为鉴定TPS基因和进行全面的进化分析提供了关键基础。本研究系统鉴定了36种植物基因组中的TPS基因家族，包括29种被子植物（26种双子叶植物和3种单子叶植物）、1种裸子植物、1种基部被子植物、1种蕨类植物、1种石松类植物、1种苔藓植物和2种藻类。这36个物种的选择遵循三个主要原则：1）范围包括被子植物、裸子植物、蕨类植物、石松类植物、苔藓植物和藻类，主要关注被子植物；2）在被子植物中，根据APG IV（被子植物系统发育组）分类系统，选择了位于关键系统发育节点的代表性物种；3）优先考虑著名的芳香植物。详细物种信息列于附表S3。本研究中分析的基因组主要从NCBI数据库和NGDC数据库下载。使用HMMER v3.3软件中的HMMscan，利用隐马尔可夫模型Terpene_synthase（PF01397）和Terpene_synthase_C（PF03936）来鉴定TPS蛋白。分析证实TPS存在于所有陆地植物中，但不存在于藻类中，这与之前关于TPS基因起源于藻类和陆地植物分化之后的发现一致。
为了可视化序列相似性并研究具有相同功能的TPS之间的进化关系，我们使用本研究中鉴定的TPS蛋白构建了一个有根系统发育树。我们采用了37个已知亚家族分类的TPS序列作为参考序列，并将它们与34种植物物种的TPS蛋白组合起来构建系统发育树，作为亚家族分类的基础。序列使用MAFFT进行比对，系统发育树使用IQ-TREE v1.6.11以最佳拟合模型JTT + F + R10构建。使用iTOL网站可视化树。参考序列从NCBI数据库或文献中获取，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）、铁皮石斛（Dendrobium officinale）、水稻（Oryza sativa）等物种的TPS蛋白。根据参考序列，将34种陆地植物中的1643个TPS分为七个亚家族：TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g和TPS-h。为了进一步揭示芳香萜类生物合成的分子机制，迫切需要更多的植物全基因组数据。
植物芳香萜类化合物生物合成关键TPS的功能与结构基础
亲缘关系远近不同的物种合成相同的芳香萜类化合物是一种常见现象，例如β-罗勒烯、柠檬烯和芳樟醇等。由于全基因组数据为TPS的系统分析提供了全面而稳定的基础，能够实现准确的鉴定和亚家族分类，因此，理解这种趋同现象根本原因的关键一步是对参与生物合成途径的TPS基因进行功能表征。负责合成相同芳香萜类化合物的TPS已在图1中标注。这些酶大部分分布在TPS-a、b、g亚家族，而一些也属于TPS-d亚家族。
β-罗勒烯是一种具有特征花香的无环单萜，能吸引传粉者并介导对草食的防御反应。它广泛分布于五个不同科的植物中，所有这些物种都有全基因组组装。在拟南芥基因组中，我们注释了47个TPS基因。研究鉴定出AtTPS03，一个属于TPS-b亚家族的β-罗勒烯合酶，并通过异源表达证实了其功能。在著名的芳香物种茉莉花（Jasminum sambac）中，β-罗勒烯是其主要花香成分之一。通过全基因组分析鉴定了47个TPS基因，并表征了JsTPS3，一个负责形成β-罗勒烯的TPS-b亚家族酶。此外，β-罗勒烯在茶（Camellia sinensis）加工过程中积累，是茶香的成分之一。基于转录组数据，鉴定了一个基因CsOCS，该基因能将GPP转化为β-罗勒烯。在注释的茶树的37个TPS基因中，与CsOCS最相似的蛋白质也属于TPS-b亚家族。类似地，在栀子（Gardenia jasminoides）中，注释了44个TPS基因，并鉴定出GjTPS2为TPS-b亚家族成员，功能研究证实了其在β-罗勒烯合成中的作用。一个编码β-罗勒烯合酶的基因ama0a23也在金鱼草（Antirrhinum majus）中被克隆和表征，后来被归类在TPS-g亚家族中。不同植物中的β-罗勒烯合酶序列相似性低，并分别归属于位于不同基因簇的TPS-b或TPS-g亚家族。我们使用AlphaFold3预测了蛋白CsOCS和AtTPS03的结构。两种蛋白质的结构比对显示，尽管它们在系统发育树上距离较远，但在底物结合的活性空腔结构上相似。此外，先前的研究也确定了控制β-罗勒烯特异性的关键氨基酸。通过序列比较，在祖先β-罗勒烯合酶的活性空腔附近鉴定出六个关键氨基酸残基。通过蛋白质建模和分子对接分析了23个残基，发现其中四个通过突变决定了TPS蛋白的β-罗勒烯形成活性。
柠檬烯是一种具有柠檬样香气的天然单萜，具有广泛的药理特性。柠檬烯合酶已在来自不同科的两个拥有全基因组的植物中被鉴定。随着茶树染色体水平参考基因组的获得，通过BLASTp分析鉴定了72个TPS，并克隆了CsTPS58，一个属于TPS-b亚家族的D-柠檬烯和α-蒎烯合酶。此外，研究也功能表征了甜橙（Citrus sinensis）中的一个(+)-柠檬烯合酶基因(+)-LS。在注释的甜橙基因组中的80个TPS蛋白中，与(+)-LS最相似的蛋白质（相似度97.53%）也被归类在TPS-b亚家族。研究比较了甜橙和留兰香（Mentha spicata）的柠檬烯合酶，发现尽管只有44.7%的序列相似性，它们的整体蛋白质折叠几乎相同。然而，C端区域的细微差异和一个保守残基的翻转改变了酶促产物的光学活性。此外，唇形科的两个物种也产生柠檬烯。全基因组分析显示，这些物种分别有63和99个TPS基因。早在1996年，研究者就从紫苏（Perilla frutescens）中克隆了两个cDNA，编码负责GPP环化产生4S-(-)-柠檬烯的TPS酶。后来，研究克隆并表征了长叶薄荷（Mentha longifolia）TPS-b亚家族中的一个柠檬烯合酶基因MlongTPS29。尽管这两种酶共享65.3%的序列同一性并在系统发育树上紧密聚集，它们的催化机制仍未解决。我们预测了紫苏中一个(-)-柠檬烯合酶的蛋白质结构，并与留兰香的(-)-柠檬烯合酶结构进行了比较。两种酶显示出惊人的相似活性空腔结构。
芳樟醇是一种广泛分布于植物中的醇类单萜，具有百合或木兰样香气。已知具有镇静和催眠特性，芳樟醇由六个不同科的物种产生。所有这些物种都有全基因组组装。我们在狭叶薰衣草（Lavandula angustifolia）基因组中注释了114个TPS，其中属于TPS-b亚家族的LaLINS编码一种能催化GPP形成芳樟醇的蛋白质。在番茄（Solanum lycopersicum）中，通过同源性搜索在基因组中鉴定出44个TPS基因。其中，属于TPS-g亚家族的TPS37和TPS39经验证可将GPP转化为芳樟醇。在葡萄（Vitis vinifera）基因组中鉴定出69个候选TPS，并表明属于TPS-b亚家族的VvPNRLin在大肠杆菌中表达时产生芳樟醇。木樨科常绿灌木桂花（Osmanthus fragrans）以其浓郁花香闻名，通过全基因组分析鉴定出42个TPS基因。通过转录组数据鉴定了一个编码芳樟醇合酶的基因OfTPS1，该基因被归类在TPS-g亚家族。类似地，在栀子（Gardenia jasminoides）中，通过全基因组分析鉴定出GjTPS27，并验证了其作为TPS-b亚家族中芳樟醇合酶的作用。总之，尽管所有这些TPS蛋白都表现出芳樟醇合成的催化活性，但它们分别属于TPS-b或TPS-g亚家族，并且不同植物中的TPS在系统发育上是不同的。此外，蔷薇科的三种植物能产生具有独特芳樟醇相关香气特征的果实。苹果（Malus domestica）、桃（Prunus persica）和玫瑰（Rosa rugosa）都有可用的全基因组组装。在苹果中，利用先前发表的TPS序列和基因组数据鉴定了55个推定的TPS基因，他们分离出MdLIS-RG1并通过在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中的瞬时表达证实了其催化GPP形成芳樟醇的能力。类似地，从桃基因组中筛选出38个TPS基因，并鉴定PpTPS3为芳樟醇合酶。体外和体内实验均证实了其在芳樟醇生物合成中的催化活性。此外，在玫瑰基因组中鉴定出52个TPS基因，并表征了RrTPS03为功能性芳樟醇合酶。RrTPS03属于TPS-a亚家族，而MdLIS-RG1和PpTPS3都被归类在TPS-g亚家族。MdLIS-RG1和PpTPS3在系统发育树上相对接近，但仅共享58.02%的氨基酸序列相似性。上述TPS蛋白的催化机制仍未解决。
香叶醇是植物中一种重要的单萜芳香化合物，以其玫瑰般甜美的香气而闻名。它对三个不同科植物的香气特征有显著贡献，所有这些物种都有已发表的全基因组组装。研究从茶树基因组中鉴定出TPS基因，并选择了高表达的候选基因。功能验证证实，属于TPS-b亚家族的CsTPS1能催化GPP形成香叶醇。此外，研究在绒毛豆蔻（Wurfbainia villosa）中发现了77个TPS基因，并功能表征了来自TPS-a亚家族的三个香叶醇合酶（WvTPS3, 25和26）。在长春花（Catharanthus roseus）中，注释了18个TPS基因，其中一种TPS-g亚家族酶经验证可产生香叶醇。有趣的是，上述香叶醇合酶来自三个不同的亚家族。这种系统发育的多样性凸显了研究这些酶尽管进化上出现分歧，却能产生相同产物的催化机制的必要性。
(+)-龙脑是传统草药中一种众所周知的挥发性成分，具有抗炎、抗菌和抗肿瘤生物活性，并可用作穿透血脑屏障的“引药”。(+)-龙脑可由TPS催化的GPP形成(+)-龙脑基二磷酸，然后经磷酸酶水解生成龙脑。(+)-龙脑基二磷酸合酶已在八个亲缘关系远近不同的物种中得到表征，每个物种都有基因组组装。研究通过全基因组分析在艾草（Artemisia argyi）中鉴定出122个TPS基因，并发现属于TPS-b亚家族的AarTPS89能在体外以GPP为底物单一产物地产生(+)-龙脑。此外，研究报道了樟树（Cinnamomum camphora）的染色体水平基因组组装，并鉴定了78个TPS基因。研究者从樟树中克隆了CcTPS9，并验证了其在合成单一产物(+)-龙脑方面的功能。类似地，(+)-龙脑也在阴香（Cinnamomum burmanni）中检测到，该物种也属于樟科。研究完成了阴香的基因组，并鉴定了73个CbTPS基因。其中，研究发现高度特异性的(+)-龙脑基二磷酸合酶CbTPS1。CcTPS9和CbTPS1都属于TPS-b亚家族。此外，在属于龙脑香科的五个物种中，通过全基因组分析鉴定出99个TPS基因，其中五个具有产生(+)-龙脑的能力。
α-蒎烯是一种众所周知的天然产物，用于香料工业，并潜在用作高密度可再生燃料的原料。α-蒎烯合酶已在五个远缘物种中被报道，其中三个有全基因组组装数据。研究异源表达并表征了陆地棉（Gossypium hirsutum）中的GhTPS2，揭示该蛋白催化底物GPP合成主要产物α-蒎烯。在大麻（Cannabis sativa）中，已鉴定出55个CcTPS，其中属于TPS-b亚家族的CcTPS2催化GPP转化为α-蒎烯。研究也表征了葡萄（Vitis vinifera）中的一个α-蒎烯合酶VvPNaPin1。此外，在火炬松（Pinus taeda）和芍药（Paeonia lactiflora）中也鉴定出两个α-蒎烯合酶，分别属于TPS-d和TPS-b亚家族。然而，这两个物种尚未有基因组组装的报道。
β-石竹烯是一种双环倍半萜，存在于四个不同科植物的精油中，广泛用于化妆品和药品。全基因组数据促进了对这些物种TPS的研究。研究通过葡萄基因组的全基因组分析发现5个编码β-石竹烯合酶的基因。其中，原核表达和表征证实，属于TPS-a亚家族的合酶VvGwECar1能将FPP转化为β-石竹烯。此外，基于狭叶薰衣草的全基因组，鉴定出100个TPS基因，并证明LaTPS76催化FPP形成β-石竹烯。闽楠（Phoebe bournei）是樟科的一种耐腐芳香木材物种，广泛用于家具制造。结合保守结构域搜索和转录组验证，鉴定出72个全长TPS基因。功能研究表明，在本氏烟草叶片中瞬时过表达基因PbTPS-a21和PbTPS-a25（均来自TPS-a亚家族）显著增加了β-石竹烯的释放。在陆地棉（Gossypium hirsutum）中，在87个鉴定的TPS基因里，GhTPS1被归类在TPS-a亚家族，并被表征为主要催化β-石竹烯合成。尽管这五个β-石竹烯合酶都被归类在同一亚家族，但它们在系统发育树上占据不同的分支，并且它们的序列在不同物种间显示低相似性。这凸显了识别和研究对其催化活性关键的保守残基的重要性。此外，菊科的两个物种都鉴定出TPS-a亚家族中的β-石竹烯合酶。这些酶的催化机制仍未解决。
α-法尼烯是一种倍半萜可再生原料，广泛用于工业、农业和能源生产等多个领域。五个拥有全基因组组装且分布于不同科的植物物种被报道具有α-法尼烯合酶。研究在啤酒花（Humulus lupulus）基因组中鉴定出87个推定的全长和部分TPS基因。其中，属于TPS-b亚家族的HlTPS3-wak-a编码一个α-法尼烯合酶。此外，研究预测了苹果（Malus domestica）中10个具有功能的TPS基因，包括在成熟果实中高表达并被归类在TPS-b亚家族的MdAFS-RG1。基于这一发现，进一步证明下调MdAFS-RG1显著降低了α-法尼烯的产量。此外，研究在栀子（Gardenia jasminoides）的44个TPS中发现一个TPS-b亚家族的蛋白质GjTPS1，并证明α-法尼烯占其FPP催化总产物的94%。α-法尼烯合酶也在茶树和葡萄中被鉴定，分别属于TPS-b和TPS-a亚家族。不同物种中的α-法尼烯合酶分布在TPS-a和TPS-b亚家族中。除了茶树、苹果和啤酒花中的TPS在进化上亲缘关系较近外，所有其他蛋白质分布更为分散，凸显了研究其催化机制的必要性。
α-檀香烯是檀香油的关键成分，具有显著的药理特性。研究者从三种檀香属（Santalum）物种：白檀（Santalum album）、澳洲檀香（Santalum austrocaledonicum）和穗花檀香（Santalum spicatum）中克隆并表征了三个直系同源的α-檀香烯合酶基因SaSSy、SauSSy和SspiSSy。所有三种酶都属于TPS-b亚家族。在这些物种中，只有白檀有已发表的基因组组装，该组装预测了六个可能编码檀香烯合酶的基因。此外，研究者试图确定SaSSy蛋白的晶体结构，但该蛋白未能产生稳定的配体结合构象。需要进一步优化以鉴定对其活性关键的功能残基。过度开发导致天然檀香资源显著减少。为了应对这一挑战，在樟树（Cinnamomum camphora，樟科）和温郁金（Curcuma wenyujin，姜科）中发现了α-檀香烯的替代来源。研究表征了樟树中的一个α-檀香烯合酶基因CiCaSSy，为可持续生产α-檀香烯提供了有前景的基础。此外，作者证明，突变樟树中一个单萜合酶的六个关键残基，可将其转化为具有与CiCaSSy相似产物谱的倍半萜合酶，突出了决定底物和产物特异性的残基。另外，研究也通过转录组分析在温郁金中发现了一个α-檀香烯合酶（CwSS），然而，温郁金的基因组尚未测序。
总之，全基因组数据为TPS的系统分析提供了全面而稳定的基础，能够实现准确的鉴定和亚家族分类。与转录组数据不同，基因组数据不受环境或时间因素的影响，可以可靠地检测基因家族扩张和进化模式。总结具有相同功能的单萜和倍半萜合酶，我们发现功能性TPS的序列分析显示，不同物种中具有相同功能的TPS通常表现出较低的序列相似性。相反，来自相同或不同植物物种的功能不同的TPS在系统发育上相对更相似。是什么原因导致了这一现象？有报道指出，由于蛋白质结构通常比序列更保守，结构相似性可以提供序列关系无法提供的大量功能信息。TPS通常拥有一个疏水的活性空腔，便于在催化过程中精确稳定和操纵反应中间体。这个活性空腔的整体结构在很大程度上决定了反应轨迹，实验证据表明其构型和周围残基对于定义产物特异性至关重要。例如，在希腊鼠尾草（Salvia fruticosa）的1,8-桉叶素合酶中，活性空腔残基Asn338突变为Ile导致产物谱显著转变，马鞭草烯和柠檬烯成为主要产物。然而，鉴于TPS的高产物多样性，识别能够调节酶功能的通用活性空腔残基的研究仍然有限。我们的结构分析显示，产生相同芳香萜类的TPS蛋白共享高度相似的活性空腔结构，即使是在远缘物种之间，无论它们的序列相似性如何。相反，具有高序列相似性但功能不同的蛋白质在其活性空腔上表现出巨大差异。此外，我们使用TM分数作为度量标准量化结构相似性，并使用US-align平台对25个功能性TPS蛋白进行结构比对。结果一致显示，在亲缘关系远近不同的物种中，具有相同功能的TPS蛋白表现出高度的结构相似性。总之，这些发现表明，蛋白质结构相似性比较可以弥补序列相似性比较的不足，并且对蛋白质功能预测具有更重要的意义。
参与芳香萜类生物合成途径的TPS的鉴定和功能表征对于阐明驱动亲缘关系远近不同的物种产生相同化合物的分子机制至关重要。虽然AlphaFold预测能可靠地捕捉TPS蛋白的整体结构架构，但实验验证对于准确建模活性空腔仍然是不可或缺的——特别是在研究具有相同功能的远近缘物种TPS的结构基础时。因此，专注于TPS蛋白晶体结构和关键残基的详细结构研究对于增进我们对这些酶催化机制的理解至关重要。
亲缘关系远近植物中相同芳香萜类生物合成TPS基因的起源模式
功能表征揭示，来自亲缘关系远近不同物种的TPS可以产生相同的芳香萜类，这一现象可能反映了TPS基因的古老起源及其通过各种基因复制事件的进化。然而，具有共享功能的芳香相关TPS基因的进化起源仍然知之甚少。比较基因组分析为不同物种间具有相同功能的TPS基因的起源提供了新视角。
植物中的基因复制可大致分为两类：全基因组复制（WGD）和单基因复制。WGD的主要后果往往是新基因功能或修饰功能的进化、提供遗传冗余以及增加非互惠重组的机会。这些因素为进化变化提供了原材料。在长时间未经历WGD的物种中，单基因复制是遗传变异的重要来源，并为适应性进化提供原材料。单基因复制包括串联复制（TD）、分散复制（DSD）、近端复制（PD）和转座复制（TRD）。在这些复制模式中，WGD、TD和DSD已被确定为驱动TPS基因家族进化的主要力量。为了阐明这五种基因复制事件对TPS多样性的贡献，我们使用DupGen_finder软件鉴定了24种被子植物中复制的TPS基因对。统计分析显示，WGD是植物中TPS基因扩张的主要模式，其次是DSD和TD。基于系统发育树，我们进一步比较了每个复制TPS基因对的亚家族分布。结果显示，WGD事件主要产生属于不同亚家族的TPS基因，而TD、DSD、PD和TRD主要产生同一亚家族内的基因对。这些发现表明，WGD事件在驱动植物TPS基因多样化方面发挥了关键作用，这与先前的文献报道一致。
此外，我们阐明了亲缘关系远近不同物种中相同功能TPS基因的起源模式，旨在从进化维度阐明其功能保守的基因组机制。我们使用DupGen_finder鉴定了功能性TPS基因的复制事件，并使用MCScanX进行了种间同线性分析。结果通过TBtools可视化。
单萜合酶基因的串联复制
TD基因对位于同一染色体上位置接近。此类复制经常涉及编码单萜和倍半萜合酶的基因，从而促进植物芳香化合物的多样化。与其他复制模式相比，TD事件显示出有偏的基因保留模式，并具有明显的谱系特异性特征。基于功能表征，我们发现了功能性单萜合酶基因中串联复制的一个例子，并追溯了它们的进化起源。
苹果和桃都属于蔷薇科，共享密切的进化关系。然而，两个芳樟醇合酶，来自苹果的MdLIS-RG1和来自桃的PpTPS3，仅共享58.02%的序列相似性，尽管两者都属于TPS-g亚家族。两个物种基因组中广泛的基因复制事件促进了TPS基因家族的扩张。我们鉴定出MdLIS-RG1和PpTPS3中发生了TD事件。在苹果中，检测到28,462个同线性基因，其中MdLIS-RG1与XM_029110429.1和XM_008385731.3形成TD基因对。在桃中，发现了4623个同线性基因，PpTPS3与XM_007213810.2呈现TD关系。为了进一步探索进化关系，我们进行了涉及苹果和桃基因组，以及来自大麻科的祖先物种啤酒花基因组的同线性分析。尽管功能相似，但在苹果和桃中未检测到MdLIS-RG1和PpTPS3之间的同线性。PpTPS3与啤酒花中的XM_062231454.1同线性，表明它直接从这个祖先基因进化而来。相反，啤酒花中没有基因与苹果基因组中的MdLIS-RG1同线性。然而，基因XM_008385731.3与啤酒花中的基因XM_062231456.1同线性。基于这些发现，我们推断MdLIS-RG1起源于苹果和桃分化后发生的TD事件后的新功能化。
单萜和倍半萜合酶基因的分散复制
DSD基因对既不相邻也不同线，其形成机制尚不清楚。DSD事件可以增加基因组冗余，从而为基因功能的分化提供机会。此类事件已在功能性单萜和倍半萜合酶基因中被鉴定。
栀子和拟南芥，分布于不同的科，都拥有β-罗勒烯合酶（GjTPS2和AtTPS03）。两种酶仅共享36.85%的序列相似性，却能催化相同的反应。基因GjTPS2和AtTPS03都参与了DSD事件。在栀子中，DSD约占所有复制基因的70%，在塑造其香气成分多样性方面起主要作用。基因GjTPS2与另外两个基因形成DSD基因对，包括编码具有不同催化功能的TPS酶的GjTPS1。在拟南芥中，AtTPS03与其他四个基因之间发生了DSD事件。同线性分析显示GjTPS2和AtTPS03之间没有同线性关系。为了探索GjTPS2的起源，我们进行了与相关物种的同线性分析，包括中果咖啡（Coffea canephora）、长春花（Catharanthus roseus）、紫苏（Perilla frutescens）、甜橙（Citrus sinensis）和无油樟（Amborella trichopoda）。结果显示，GjTPS2在茜草科内是保守的，也存在于唇形科和芸香科的物种中，表明其在蔷薇类植物中甚至可追溯到基部被子植物是保守的。然而，AtTPS03显示出独特的进化模式。先前文献报道AtTPS03包含在十字花科基因的独立同线性簇
