《American Journal of Primatology》：To be or Not to be Hybrids? A Case-Study in an Allochthonous Population Involving Illegal Introductions of the Endangered Golden-Headed and Golden Lion Tamarins
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本文通过基因分型测序（GBS）和线粒体分析，深入研究了巴西大西洋森林片段中非法引入的濒危金头狮面狨（Leontopithecus chrysomelas, GHLT）和金狮面狨（Leontopithecus rosalia, GLT）外来种群的杂交状况与遗传多样性。研究排除了杂交个体的存在，揭示了外来种群（NIT）具有较高遗传多样性（HE=0.376）和有效种群大小（NE=26.2），并强调其通过竞争和潜在杂交对本地GLT构成的威胁。结果为两种濒危物种的保护计划与管理行动提供了关键遗传学依据。
1 引言
外来物种的引入可能通过引入新病原体、加剧资源竞争、促进栖息地改变和造成生态系统破坏而对生物多样性产生负面影响。引入物种还可能扩散到指定用于保护本地物种的区域。这种定殖以及历史上隔离谱系之间的接触可能导致杂交，从而降低后代适应性，或相反地促进杂种优势，威胁本地种群的完整性并增加其灭绝风险。
狮面狨是狮面狨属（Leontopithecus）的新热带灵长类动物，包括四种分布于巴西大西洋森林的特有同域物种。所有四种物种都面临不同程度的威胁。金头狮面狨（GHLT） endemic 于巴伊亚州南部的低地大西洋森林，而金狮面狨（GLT）栖息在里约热内卢州沿海的大西洋森林。
根据Pri-Matas研究所的数据，1994年，在里约热内卢州尼泰罗伊市的Serra da Tiririca州立公园非法释放了两雄两雌金头狮面狨以及一雄一雌金狮面狨，该区域位于金狮面狨的自然分布范围内。这种非法引入引发了关于外来物种如何通过促进其传播和种群增长成为入侵物种，和/或通过出现人工杂交区（可产生可存活且可育的后代）来影响当地生物多样性的担忧。
在狮面狨属中，金头狮面狨和金狮面狨之间产生可存活和可育后代的杂交事件已在异地条件下被报道。因此，这些狮面狨的非法引入非常令人担忧，特别是如果发生杂交。尽管杂交种可能表现出与其亲本物种中间类型的表型，但来自单一父本或母本的基因优势可能产生在形态上与仅一个亲本物种非常相似的个体，从而产生隐性杂交种。
除了杂交事件，引入物种可能通过扩张到指定用于本地物种保护的地区而对本地物种构成重大威胁。这种入侵可能损害历史上隔离的谱系或物种的遗传完整性。此外，非本地物种可能适应它们以前不适应的环境，有时与本地物种竞争。外来物种的成功可能归因于其比本地物种更具竞争力，或缺乏选择压力。
另一方面，引入的物种通常会经历极端的奠基者效应，导致遗传多样性是原始种群的一个子集，进一步导致快速的遗传侵蚀。奠基者效应可能迅速改变等位基因频率，导致某些有害等位基因频率增加。然后，遗传漂变可能促进这些等位基因的固定。此外，如果在一个新区域建立，没有后续的新引入，外来物种往往会因近交而丧失适应性。
本研究分析了一个狮面狨的外来种群，该种群源于金狮面狨和金头狮面狨个体在巴西大西洋森林保护区的非法引入，该区域靠近金狮面狨的剩余自然分布范围。主要目标是调查杂交的存在，以促进两种物种的保护计划和管理行动，并推断与奠基者效应和/或潜在杂交相关的可能影响。
2 材料与方法
2.1 法律与伦理要求
生物样本收集遵循了圣卡洛斯联邦大学动物使用和实验伦理委员会（CEUA-UFSCar）、生物多样性授权和信息系统（SISBIO）以及国际灵长类学会和美国灵长类学家协会推荐的野外灵长类学最佳实践规范所确立的伦理和法律标准。遗传遗产的获取在国家遗传遗产管理系统（SisGen）注册。
2.2 研究标本与区域背景
2.2.1 尼泰罗伊（巴西里约热内卢州）Serra da Tiririca州立公园
根据Pri-Matas研究所的数据，1994年，在尼泰罗伊市Serra da Tiririca州立公园非法释放了两雄两雌金头狮面狨以及一雄一雌金狮面狨。然而，2009年的一次普查估计，尼泰罗伊地区大约有200只非本地狮面狨。所有个体都表现出金头狮面狨的表型，并在兽医检查后被确认为可育。
在随后的几年里，这个非本地种群经历了显著增长。因此，Pri-Matas研究所发起了一项协调保护工作，重新安置和绝育这些狮面狨，以防止其扩张到金狮面狨当前存在的森林片段。从2011年3月到2013年12月，大约300只外来个体被转移到巴伊亚州的一个森林片段，该地处于金头狮面狨的原始分布范围内，但没有本地个体。许多来自尼泰罗伊的外来个体被带入圈养条件。
2.3 生物样本与DNA提取
总共对44只狮面狨进行了采样，包括7只金狮面狨、5只金头狮面狨、31只来自尼泰罗伊地区的外来标本和1只圈养杂交个体。外来标本的生物样本在尼泰罗伊市Serra da Tiririca州立公园内及周围的九个地理点收集。圈养杂交个体和两个亲本物种的生物样本从里约热内卢灵长类中心获得。
血液和组织样本的程序由兽医进行。大约每只个体采集0.2至0.5 mL外周血。组织样本在个体死亡后进行尸检收集。DNA分别使用苯酚/氯仿和盐溶液从组织和血液中提取。使用Qubit荧光计和Nanodrop分光光度计评估DNA完整性和数量。
2.4 基因分型测序分析
2.4.1 基因组文库构建与测序
基因组文库按照Elshire等人的方法构建。使用PstI酶消化DNA样本，进行连接反应，纯化，并通过PCR扩增。文库在Illumina HiSeq. 2500平台上进行测序。
2.4.2 GBS数据处理
使用iPyRAD流程进行数据处理。对单端 reads 进行去复用，修剪接头和条形码序列，并过滤Phred质量QScore < 20的 reads。序列与黑狮面狨参考基因组比对，使用90%序列相似性阈值识别SNP和直系同源位点。最终数据过滤使用r2vcftools包进行，保留双等位基因位点，排除缺失数据超过70%的个体，并进行哈迪-温伯格平衡检验。
2.4.3 推定中性与异常SNP的检测
使用PCAdapt进行主成分分析，基于马氏距离识别推定的中性和异常位点。异常值根据错误发现率确定。中性SNP随后用于评估遗传多样性、推断种群结构以及搜索杂交迹象。
2.4.4 种群结构与遗传多样性
使用Adegenet包进行判别分析主成分分析和主成分分析。使用非负矩阵因子分解和最小二乘优化程序估计个体祖先成分和种群聚类。计算成对FST。使用连锁不平衡方法估计有效种群大小。
使用F3统计检验混合。如果f3显著为负，则表明种群C是种群A和B的混合。
使用Hierfstat包计算遗传多样性参数，包括观察杂合度、期望杂合度和近交系数。使用重采样方法比较具有不等样本大小的种群之间的期望杂合度。
2.5 线粒体分析
进行细胞色素c氧化酶I亚基I基因的PCR扩增。PCR产物进行测序。获得的序列用于构建单倍型网络和贝叶斯系统发育树。
3 结果
3.1 SNP数据
基因组库测序产生了总共122,524,900条原始 reads。经过处理，获得了总共5,959个双等位基因位点，用于38个个体。其中4,070个位点被认为是中性的，用于后续种群分析。
sNMF分析显示存在两个祖先遗传群。所有金狮面狨个体显示出属于单一遗传簇的相同概率，而所有金头狮面狨个体显示出相似的成员比例。尼泰罗伊的标本与圈养的金头狮面狨标本聚集在一起。圈养杂交个体出现在两个主成分之间更中心的位置。
尼泰罗伊标本与金头狮面狨之间的固定指数值非常低。相反，金狮面狨与金头狮面狨和尼泰罗伊之间的固定指数值较高。
对于已知的杂交种与金狮面狨和金头狮面狨的源样本相比，发现了显著负的F3统计量。对于来自尼泰罗伊的个体与相同的源样本相比，发现了显著正的F3统计量值。这表明外来种群并非源于两个物种的混合。
关于遗传多样性参数，所有分析的物种和/或种群发现了等位基因丰富度的可比值。然而，金狮面狨的期望杂合度小于圈养条件下的金头狮面狨和尼泰罗伊种群的期望杂合度。尼泰罗伊种群和来自CPRJ的金头狮面狨样本显示出相似的期望杂合度估计值。圈养的金头狮面狨发现了略微显著的杂合度过量。另一方面，尼泰罗伊种群表现出观察杂合度低于期望杂合度。由于采样个体数量少，无法估计金狮面狨和来自CPRJ的金头狮面狨的有效种群大小，然而，尼泰罗伊种群显示出相对较高的估计值。
当使用标准化的种群大小考虑子样本时，尼泰罗伊种群的期望杂合度与来自CPRJ的金头狮面狨发现的相似。相反，与金狮面狨相比，尼泰罗伊种群显示出更高的平均期望杂合度。
3.2 线粒体数据
COI基因扩增产生了长度从684到703 bp的序列。比对和编辑后，获得了571 bp的片段，显示出金头狮面狨和金狮面狨之间有15个多态性位点。结果区分了两个物种，并证实了金头狮面狨对圈养杂交个体的母系贡献。系统发育树显示尼泰罗伊的标本与金头狮面狨聚集在一起，而单倍型网络显示它们之间有共同的单倍型。
4 讨论
基于本研究采用的基因组学方法和补充线粒体分析，在尼泰罗伊地区的狮面狨中没有发现近期杂交的证据。线粒体分析清楚地区分了两个物种，SNP和COI数据集均未显示该区域存在金狮面狨，表明引入的个体是纯种的金头狮面狨。此外，基因组分析估计入侵种群具有相对较高的遗传多样性，引发了对其在靠近金狮面狨当前分布区持续存在的担忧。
使用SNP的种群分析显示，圈养的金头狮面狨和尼泰罗伊的标本彼此具有相似的祖先比例，并且它们不同于金狮面狨和圈养杂交种。线粒体分析证实了金头狮面狨对圈养杂交个体的母系贡献。固定指数表明尼泰罗伊的标本与圈养条件下的金头狮面狨之间存在非常轻微的分化。相反，金狮面狨与尼泰罗伊种群标本之间的固定指数相当高，表明它们之间存在高度的遗传分化。
尽管本研究结果不担心可育杂交种可能对其亲本物种产生的负面影响，但尼泰罗伊的外来标本仍然对金狮面狨构成威胁。这个外来种群已显示出很好地适应了该区域，定期繁殖，并极大地增加了其种群数量。由于种群规模的大规模增长，以及金头狮面狨扩张对本地金狮面狨构成的风险，已经采取了保护管理行动来转移外来狮面狨。
这些个体容易适应、繁殖然后扩大种群规模的能力可能使它们能够克服地理隔离，潜在地增加其分布范围，这可能促进与最近的金狮面狨种群的未来竞争和/或杂交。外来物种的种群扩张已在其他柽柳猴科动物中有报道。
关于所分析动物中缺乏金狮面狨，很难推断1990年代引入的该物种配偶在生存能力和繁殖方面发生了什么。然而，如果金狮面狨产生了后代，它们已不在尼泰罗伊地区。在金头狮面狨入侵种群扩张期间可能取代了金狮面狨。
物种替代被描述为当本地和非本地物种竞争资源和栖息地时常见的现象。外来物种可能由于新的环境条件或这些物种固有的特定性状而成功取代本地物种。
考虑到尼泰罗伊地区缺乏金狮面狨和杂交种的情况，并基于历史记录和野外观察，该入侵种群的建立可能仅来自两雄两雌金头狮面狨。然而，使用总样本量发现入侵种群的期望杂合度相对较高。该值显著高于金狮面狨，并且与圈养条件下的金头狮面狨发现的相似。另一方面，它们之间的等位基因丰富度值都是可比的。
由于本研究是第一个使用SNP来表征金头狮面狨和金狮面狨的异地和就地种群遗传多样性的研究，因此没有其他狮面狨属物种的SNP信息可供比较。然而，已有报道称濒危物种基于SNP的杂合度水平非常低。实际上，对新热带灵长类动物的群体基因组研究至今仍然很少，基因组数据通常仅限于解决进化问题的方法，采样通常限于每个物种一个个体。
在一些濒危物种中，特别是在经历瓶颈事件后，观察到自然遗传多样性恢复。强烈的瓶颈通常导致遗传多样性丧失，然而，小型或奠基种群的快速生长可以减轻遗传侵蚀并促进适应性变化。
经历过近期瓶颈的种群通常表现出杂合度过量，观察杂合度超过期望杂合度，如本研究中分析的异地金头狮面狨种群。此外，异地种群可能表现出比期望杂合度更高的观察杂合度，这是由于辅助遗传管理以避免近交增加和随之而来的适应性丧失。另一方面，杂合子缺陷可能与近交率增加有关，这通常在随机近交的小种群中观察到。因此，在金头狮面狨外来种群中观察到的轻微杂合度缺陷可能是种群扩张过程中潜在近交的结果。总体而言，尽管本研究结果表明由于尼泰罗伊外来种群的扩张可能保持了遗传多样性，但近交系数表明遗传上更密切相关的个体之间存在近交趋势。也不能排除未知的额外引入事件，因为多年来的不同非法引入事件也可能解释高遗传多样性和估计的有效种群大小。
5 结论
本研究阐明了尼泰罗伊地区金狮面狨和金头狮面狨之间的杂交问题，表明外来种群的分析样本中不存在杂交种。这项研究建立了一种基于SNP的有效协议，用于识别这些濒危物种之间的杂交种，为旨在调查狮面狨属内杂交的进一步研究提供了模型研究。此外，这是首次使用大规模SNP数据集评估濒危狮面狨属物种异地和就地种群遗传多样性参数的研究。数据显示，金头狮面狨的估计遗传多样性往往高于金狮面狨，这对金狮面狨的未来保护具有影响，因为持续存在物种替代的担忧。我们的结果有助于进一步决策所研究的外来种群的管理以及金狮面狨和金头狮面狨两种物种的保护计划。
