《Journal of Environmental Sciences》：WTAP upregulates HK2 expression via m6A methylation to reprogram cell glycolysis and stemness under Cr(VI) exposure
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本研究针对六价铬[Cr(VI)]暴露诱发肺癌但表观遗传机制不清的问题，揭示了WTAP通过m6A甲基化上调HK2表达，重编程细胞糖酵解和增强干细胞特性的新机制。研究人员通过细胞/动物模型和职业人群样本，证实WTAP/HK2轴在Cr(VI)致癌中的关键作用，为铬暴露人群提供了新型生物标志物。
六价铬[Cr(VI)]是一种明确的环境致癌物，长期吸入暴露可导致肺癌。尽管其工业应用广泛，使得环境与职业铬暴露成为日益严重的公共卫生问题，但Cr(VI)诱发肺癌的具体分子机制，尤其是表观遗传层面的调控机制，仍有待深入阐明。同时，开发能够有效预警铬暴露健康风险、实现早期诊断和精准预防的可靠生物标志物也面临挑战。近年来，RNA表观遗传修饰，特别是N6-甲基腺苷(m6A)修饰，作为连接基因转录和蛋白质表达的关键节点，为发现新型生物标志物提供了新视角。
在此背景下，发表于《Journal of Environmental Sciences》的一项研究，深入探究了m6A甲基化关键调控蛋白WTAP在Cr(VI)诱导细胞恶性转化中的作用及其机制。研究人员旨在回答几个关键科学问题：Cr(VI)暴露如何影响m6A修饰水平？WTAP在Cr(VI)转化的细胞中表达与功能如何？WTAP的下游调控靶点是什么？WTAP及其潜在靶点能否作为铬暴露的生物标志物？
为了回答这些问题，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究材料包括Cr(VI)暴露的小鼠模型肺组织、人支气管上皮细胞模型（正常BEAS-2B细胞及其Cr(VI)转化细胞CrT）、肺癌A549细胞，以及来自职业铬暴露工人和对照人群的外周血单核细胞(PBMCs)样本（样本队列来源注明）。关键技术涵盖：m6A斑点印迹和免疫组化检测整体m6A水平；Western blotting、RT-qPCR、免疫组化分析基因/蛋白表达；细胞转染（过表达/干扰）进行功能获得/缺失研究；CCK-8法检测细胞增殖；生物信息学分析（基因集富集分析GSEA、加权基因共表达网络分析WGCNA、差异表达分析、通路富集分析、干细胞指数mRNAsi计算、代谢流METAFlux分析）；分子对接预测蛋白质-RNA相互作用；以及m6A RNA免疫共沉淀测序(MeRIP-qPCR)验证特异性m6A修饰位点。
3.1. Cr(VI)暴露诱导小鼠肺组织和人支气管上皮细胞m6A RNA甲基化
通过小鼠模型发现，Cr(VI)暴露引起肺组织炎症并显著升高m6A修饰水平。在细胞层面，基于蛋白质组学数据的GSEA分析显示，Cr(VI)转化细胞(CrT)的RNA甲基化水平显著高于正常细胞(B2BR)。m6A斑点印迹实验进一步证实，无论是短期Cr(VI)处理还是长期转化的CrT细胞，其m6A水平均显著增加。这些结果从组织和细胞水平共同证明Cr(VI)诱导m6A RNA甲基化修饰。
3.2. Cr(VI)暴露诱导m6A定位蛋白WTAP高表达
Western blot分析显示，在CrT细胞和肺癌A549细胞中，WTAP表达显著上调，且其上调幅度高于其他m6A相关蛋白（如METTL3）。在正常支气管上皮细胞中，Cr(VI)以浓度依赖和时间依赖的方式诱导WTAP的mRNA和蛋白表达上调。此外，在肺鳞癌(LUSC)组织中，WTAP在mRNA和蛋白水平也显著高表达。这表明WTAP在Cr(VI)诱导的细胞转化和LUSC发展中可能起关键作用。
3.3. WTAP调控细胞增殖和干性并与患者总生存期相关
功能实验表明，干扰WTAP表达能显著降低CrT细胞的增殖速率。干细胞特性分析发现，Cr(VI)处理细胞和CrT细胞均表现出增强的干性特征，且WTAP高表达与较高的干细胞指数显著正相关。Western blotting证实CrT细胞中干细胞标志物CD133表达升高，且过表达WTAP可上调CD133。临床数据分析显示，WTAP高表达的肺鳞癌患者总生存期显著缩短，并且在癌症早期阶段（I-III期）WTAP表达已高于正常组织。这些结果提示WTAP通过调控细胞干性参与肿瘤进展。
3.4. Cr(VI)暴露诱导异常细胞糖酵解
对B2BR和CrT细胞的蛋白质组学数据分析发现，Cr(VI)转化引起多种代谢通路异常，其中糖代谢是核心枢纽。代谢流分析表明，与B2BR细胞相比，CrT细胞的葡萄糖摄取显著增加。对公共基因表达数据集(GSE24025)的再分析也发现，Cr(VI)诱导的转化细胞中糖酵解通路显著上调。这共同说明Cr(VI)暴露导致细胞糖酵解代谢重编程。
3.5. WTAP参与细胞糖酵解代谢
通过WGCNA分析肺鳞癌(TCGA)数据，发现与WTAP表达最相关的基因模块（MEturquoise模块）显著富集于葡萄糖分解代谢等通路。进一步分析显示，WTAP高表达样本的乳酸生成和释放通量显著更高，表明WTAP与增强的糖酵解流相关。
3.6. Cr(VI)诱导的WTAP通过上调HK2调控细胞糖酵解和干性
多组学数据及实验验证均表明，在Cr(VI)处理或转化的细胞中，糖酵解关键限速酶HK2和PFKM表达上调。功能实验揭示，WTAP的表达变化能特异性调控HK2，而非PFKM的表达。相关性分析显示WTAP与HK2表达正相关，且HK2高表达与高干细胞指数及不良预后相关。最关键的是，在WTAP过表达的细胞中敲低HK2，可以部分逆转WTAP对干细胞标志物CD133的上调作用，证明HK2是WTAP调控细胞干性的关键下游效应分子。
3.7. WTAP参与HK2 mRNA的m6A RNA甲基化
生物信息学预测发现HK2 mRNA的3‘UTR区域存在高概率的m6A修饰位点（site2）。分子对接模拟显示WTAP-VIRMA蛋白复合物能与HK2的site2序列稳定结合。MeRIP-qPCR实验证实CrT细胞中HK2的site2位点存在显著的m6A富集，且此富集在WTAP敲低后明显减弱，证明WTAP特异性介导了HK2 mRNA该位点的m6A甲基化。
3.8. WTAP和HK2是Cr(VI)暴露的潜在生物标志物
对职业铬暴露工人和对照人群血液样本的RNA测序分析显示，暴露组中WTAP和HK2的表达水平均显著高于对照组，且两者表达呈显著正相关。这提示WTAP和HK2有潜力作为监测人体铬暴露的分子生物标志物。
综上所述，本研究系统阐明了Cr(VI)致癌的一种新型表观遗传机制：Cr(VI)暴露通过上调WTAP，进而以m6A依赖的方式促进HK2的表达，从而重编程细胞糖酵解代谢并增强细胞干性，最终驱动细胞恶性转化。研究不仅揭示了环境致癌物作用的新通路，更重要的是，提出了WTAP和HK2作为铬暴露人群风险监测和早期预警的潜在新型生物标志物组合，为环境相关肿瘤的预防和精准医学提供了新的思路和靶点。尽管研究在代谢流变化的直接功能验证方面存在局限，但其多层次的证据链有力地支持了核心结论，为后续深入研究奠定了基础。
