一种基于β2-AR/CysLT1R/M3R色谱法以及小鼠模型，用于筛选和评估来自原始Farfarae Flos（远志花）及经过蜂蜜处理后的Farfarae Flos中的镇咳、抗炎和祛痰活性成分的通用策略

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：A general strategy to screen and evaluate antitussive, anti-inflammatory, and expectorant active components from raw and honey-fired Farfarae Flos based on β 2-AR/CysLT 1R/M 3R chromatography and mice models

远志花及其蜜制品通过受体色谱法结合小鼠模型筛选出止咳、抗炎和祛痰活性成分，发现氯ogenic酸和咖啡酸靶向β2-AR，氯ogenic酸和芦丁靶向CysLT1R，氯ogenic酸及异氯arkin酸A、B、C靶向M3R，首次证实芦丁与CysLT1R、异氯arkin酸与M3R的相互作用，证实蜜制对药效无显著影响，并建立炮制工艺与药效关联的通用框架。

　　

作者名单：王亚琪|舒平|吕梅|邢永浩|张浩然|严晓静|王波|黄婷婷|方敏峰

中国陕西省西安市西北大学生命科学学院资源生物学与生物技术教育部重点实验室，邮编710069

摘要

Farfarae Flos及其蜂蜜加工产品被用于治疗呼吸系统疾病，但其活性成分和作用靶点至今尚不明确。本研究采用受体色谱法和小鼠模型相结合的策略，对Farfarae Flos的原始形式和蜂蜜加工形式中的活性成分进行了筛选和评估。我们重点研究了三种关键受体：β₂-AR、CysLT₁R和M₃R，这些受体被认为与止咳、抗炎和祛痰作用有关。我们将这些受体固定在硅胶上，构建了亲和柱。通过这些柱子，我们鉴定了Farfarae Flos两种形式中的生物活性化合物。结果表明，原始形式和蜂蜜加工形式中的目标特异性化合物是一致的：绿原酸（CGA）和咖啡酸（CA）作用于β₂-AR；CGA和芦丁与CysLT₁R结合；CGA以及异绿原酸A、B和C与M₃R相互作用。值得注意的是，芦丁与CysLT₁R以及异绿原酸A、B和C与M₃R的相互作用是首次被报道。这些发现表明，原始形式和蜂蜜加工形式的Farfarae Flos在止咳、抗炎和祛痰作用方面具有相同的物质基础，且蜂蜜加工并未显著改变其药理效应。此外，生物活性化合物与受体的结合亲和力与分子对接预测的化合物-受体复合物的结合能高度吻合。据我们所知，这是首次针对原始形式和加工形式Farfarae Flos进行的以靶点为中心的比较分析。该研究为研究草药加工引起的药理学变化提供了一个可推广的框架，并提供了将代谢组学特征与临床疗效联系起来的实证证据。

引言

Farfarae Flos（学名：Tussilago farfara L.），俗称款冬花，属于菊科植物[1]。自《神农本草经》（现存最古老的中国药典）以来就有记载，传统上用于治疗慢性咳嗽、支气管炎和哮喘等呼吸系统疾病[2]。该植物主要在中国西北地区种植，包括甘肃、河北、山西和陕西等省份[3]。植物化学分析显示，Farfarae Flos含有多种生物活性化合物，如倍半萜类、苯丙素类、黄酮类、氨基酸、生物碱、色酮类、香豆素类和碳水化合物[4]。这些成分与Farfarae Flos在呼吸系统和心血管系统的刺激作用、祛痰效果、止咳、抗炎、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗氧化、止泻和镇痛作用密切相关[1]、[5]、[6]、[7]。传统应用中更倾向于使用蜂蜜加工后的Farfarae Flos，因为这种加工方式增强了其润肺和止咳效果[8]。 蜂蜜加工（中文称为“炮制”）是一种古老的中国特色中药处理方法，基于中医理论[9]。除了蜂蜜加工外，还包括炒制、切碎、碾压、烘烤、蒸煮和炖煮等多种技术[10]。这些过程可能会改变原始草药中的治疗成分，从而通常能增强治疗效果、减少副作用和毒性、改善风味，并改变草药的治疗方向和性质[11]、[12]。与原始形式的Farfarae Flos相比，蜂蜜加工后的形式在润肺和止咳效果上更为显著[8]。 此前已有基于液相色谱-质谱的代谢组学方法对原始形式和蜂蜜加工后的Farfarae Flos进行了全面的化学比较[13]、[14]。蜂蜜加工后的Farfarae Flos含有原始草药中检测到的所有114种化合物[14]。通过多变量统计分析，确定了原始草药和蜂蜜加工后草药之间的68种差异化合物，包括6种苯丙素类、13种氨基酸、18种倍半萜类、10种生物碱、2种色酮类、3种黄酮类和6种其他化合物[14]。这些差异化合物可能是蜂蜜加工后Farfarae Flos疗效增强的重要物质基础。然而，这些化学变化与临床效果之间的药效机制尚未得到验证。此外，尚未有研究系统地比较原始形式和加工形式Farfarae Flos的靶点特异性生物活性。 现代药理学已经阐明了呼吸系统治疗的关键分子靶点[15]，例如β₂-肾上腺素受体（β₂-AR）、半胱氨酰白三烯受体1（CysLT₁R）和毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3（M₃R）。β₂-AR的激动剂可松弛支气管平滑肌，有效保持气道通畅并维持正常呼吸功能（即止咳作用）[16]、[17]；CysLT₁R的拮抗剂可减少支气管收缩、气道炎症和水肿，同时降低黏液分泌和嗜酸性粒细胞浸润（即抗炎作用）[18]；M₃R的拮抗剂可舒张支气管、减少黏液分泌、缓解气道高反应性并改善肺功能（即祛痰作用）[19]、[20]。β₂-AR的激动剂以及CysLT₁R和M₃R的拮抗剂是治疗支气管炎、哮喘和慢性阻塞性肺疾病的一线疗法[21]、[22]。然而，它们与Farfarae Flos成分的相互作用尚未被探索。 在本研究中，我们专注于上述三个治疗靶点，旨在明确原始形式和蜂蜜加工后Farfarae Flos中的止咳、抗炎和祛痰活性成分。利用基因工程技术，我们在大肠杆菌（E. coli）中表达了β₂-AR、CysLT₁R和M₃R的重组蛋白，并在其C端添加了Halo标签。然后通过Halo标签技术将这些重组蛋白固定在6-溴己酸功能化的硅胶上，将所得凝胶装入三个独立的30 × 4.6毫米柱中。我们利用这些亲和柱筛选原始形式和蜂蜜加工后Farfarae Flos中的潜在生物活性成分，并通过质谱法确定了与这三个治疗靶点结合的成分。本研究首次报道了芦丁与CysLT₁R以及异绿原酸A、B和C与M₃R的相互作用。随后通过三种独立的小鼠模型评估了这些成分的止咳、抗炎和祛痰作用。最后，还通过注射量依赖性分析和分子对接研究了这些成分与三个靶点的相互作用。我们的工作是首次针对原始形式和加工形式Farfarae Flos进行的以靶点为中心的比较分析，为研究加工引起的药理学变化提供了一个可推广的框架，并提供了将代谢组学变化与临床疗效联系起来的实证证据。

材料与仪器

原始Farfarae Flos由陕西省神木德康健中药种子有限公司提供，并经西北大学方敏峰教授鉴定。用于大肠杆菌（E. coli）培养的胰蛋白胨、酵母提取物和氨苄西林钠，以及HPLC级别的甲醇和乙腈均购自Thermo Fisher Scientific公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。多孔硅胶（孔径：250 ?，粒径：5.0 μm）由兰州化学物理研究所提供。

三种受体的表达、固定和表征

β₂-AR、CysLT₁R和M₃R的C端添加了Halo标签，并如前所述[23]、[24]、[25]在大肠杆菌中表达。如图1a所示，SDS-PAGE分析显示这三个受体的目标条带分别约为80.0 KDa、72.4 KDa和74.7 KDa，与它们的理论分子量一致，证实了这些受体的成功表达。 这些受体的固定是通过...

结论

本研究旨在从治疗靶点的角度阐明蜂蜜加工对Farfarae Flos化学组成和药理疗效的影响。所采用的策略为研究草药加工引起的药理学变化提供了一个可推广的框架，特别是对于那些通过多个治疗靶点协同作用并用于治疗复杂病理机制疾病的草药而言。尽管...

作者贡献声明

黄婷婷：实验研究、数据分析。 王波：实验研究、数据分析。 王亚琪：初稿撰写、实验研究。 方敏峰：撰写、审稿与编辑、指导。 吕梅：验证。 舒平：数据管理。 张浩然：实验研究、数据分析。 邢永浩：实验研究、数据分析。 严晓静：实验研究、数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

感谢陕西省“秦药”研发重点实验室（2021-QYPT-001）和陕西省“秦药”质量提升项目（2021-QYZL-01）的财政支持。