《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：Silencing IFI6 enhances radiation sensitivity of triple-negative breast cancer via ER stress-driven immunogenic cell death
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为解决三阴性乳腺癌（TNBC）放疗抵抗的临床难题，本研究聚焦于干扰素-γ诱导蛋白6（IFI6）。研究发现，沉默IFI6可通过激活内质网应激（ERS）和活性氧（ROS）积累，诱导免疫原性细胞死亡（ICD），从而显著增强TNBC细胞的放射敏感性。该研究揭示了IFI6作为TNBC放疗增敏新靶点的潜力，为克服放疗抵抗提供了新策略。
三阴性乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer, TNBC）是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，其治疗选择有限，预后极差。放疗是TNBC治疗的重要手段，但肿瘤细胞对放疗的抵抗（即放射抵抗）是导致治疗失败和肿瘤复发的主要原因。因此，寻找能够逆转TNBC放射抵抗的有效靶点，是当前临床面临的巨大挑战。
免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death, ICD）是一种特殊的细胞死亡方式。当肿瘤细胞发生ICD时，它们会释放一系列“危险信号”，如钙网蛋白（Calreticulin, CRT）在细胞膜表面的暴露、ATP的分泌以及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的释放。这些信号能够激活机体的免疫系统，像“警报”一样，引导免疫细胞来识别并攻击肿瘤细胞。因此，诱导ICD被认为是增强放疗效果、克服放射抵抗的理想策略。
干扰素-γ诱导蛋白6（Interferon-γ-inducible protein 6, IFI6）是一种与细胞应激反应密切相关的蛋白。已有研究表明，IFI6在多种肿瘤中高表达，并可能通过调节线粒体功能和氧化还原平衡来保护细胞免受损伤。然而，IFI6在TNBC放射抵抗中扮演何种角色，以及它是否与ICD的发生有关，尚不明确。
为了回答这些问题，研究人员在《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》上发表了一项研究，旨在揭示IFI6在TNBC放射抵抗中的作用及其分子机制。他们假设，靶向抑制IFI6可能通过激活内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ERS）来诱导ICD，从而增强TNBC对放疗的敏感性。
为了验证这一假说，研究人员首先通过分次照射构建了具有放射抵抗性的TNBC细胞系（MDA-MB-231/IR）。随后，他们利用慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）技术，在放射抵抗细胞中特异性沉默IFI6的表达。通过一系列体外实验，他们系统评估了IFI6沉默对细胞存活、凋亡、ICD标志物释放、内质网应激通路激活以及活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平的影响。最后，他们使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）进行挽救实验，以确证IFI6通过内质网应激通路发挥功能。
本研究主要采用了以下关键技术方法：
- 1.
细胞模型构建： 通过分次照射（累计剂量50 Gy）建立放射抵抗的TNBC细胞系（MDA-MB-231/IR）。
- 2.
基因沉默： 利用慢病毒介导的shRNA技术，在放射抵抗细胞中特异性敲低IFI6基因的表达。
- 3.
功能学检测： 采用CCK-8法检测细胞活力，克隆形成实验评估放射敏感性，流式细胞术检测细胞凋亡。
- 4.
免疫原性细胞死亡（ICD）评估： 通过免疫荧光检测钙网蛋白（CRT）膜暴露，化学发光法检测ATP分泌，流式细胞术和蛋白质印迹（Western Blot）检测HMGB1释放。
- 5.
机制探索： 通过蛋白质印迹检测内质网应激通路关键蛋白（GRP78, IRE1α, PERK, p-PERK, ATF6）的表达，流式细胞术和ELISA检测活性氧（ROS）和氧化应激标志物（MDA, SOD）水平。
- 6.
挽救实验： 使用内质网应激抑制剂4-PBA处理细胞，验证IFI6通过内质网应激通路调控放射敏感性的机制。
研究结果
IFI6在放射抵抗的TNBC细胞中高表达
研究人员首先发现，与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，TNBC细胞系MDA-MB-231中IFI6的表达显著升高。更重要的是，在通过分次照射建立的放射抵抗细胞系MDA-MB-231/IR中，IFI6的mRNA和蛋白水平进一步显著上调。这表明IFI6的表达与TNBC的放射抵抗表型呈正相关。
沉默IFI6增强放射抵抗细胞的放射敏感性
为了验证IFI6的功能，研究人员在放射抵抗的MDA-MB-231/IR细胞中沉默了IFI6的表达。结果显示，单独沉默IFI6即可降低细胞活力，而当联合放疗时，细胞存活率进一步显著下降。流式细胞术检测细胞凋亡的结果也证实，沉默IFI6联合放疗，能够显著增加放射抵抗细胞的凋亡比例。这些结果表明，沉默IFI6能够有效逆转TNBC细胞的放射抵抗表型，使其对放疗更加敏感。
沉默IFI6促进放射诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）
为了探究沉默IFI6增强放射敏感性的机制，研究人员检测了ICD的关键标志物。他们发现，在放射抵抗细胞中，单纯放疗并不能有效诱导ICD。然而，沉默IFI6后，细胞开始释放ICD信号：细胞膜表面的钙网蛋白（CRT）暴露显著增加，细胞外ATP和HMGB1的释放量也显著升高。当沉默IFI6与放疗联合时，这种ICD效应被进一步放大。这表明，沉默IFI6能够将放疗从一个“亚致死”的应激信号，转化为一个有效的“免疫原性”死亡信号。
沉默IFI6激活内质网应激（ERS）
为了阐明沉默IFI6诱导ICD的上游机制，研究人员检测了内质网应激通路。蛋白质印迹结果显示，沉默IFI6能够显著上调内质网应激标志蛋白GRP78、IRE1α、ATF6以及磷酸化PERK（p-PERK）的表达。同时，沉默IFI6还导致了细胞内活性氧（ROS）的显著积累，并伴随着氧化应激标志物丙二醛（MDA）水平的升高和超氧化物歧化酶（SOD）活性的降低。这些结果表明，沉默IFI6通过激活内质网应激和氧化应激，为ICD的发生创造了条件。
内质网应激抑制剂逆转沉默IFI6的调控效应
为了确证内质网应激是沉默IFI6发挥作用的关键通路，研究人员进行了挽救实验。他们使用内质网应激抑制剂4-PBA处理细胞。结果发现，4-PBA能够有效逆转由沉默IFI6引起的内质网应激通路激活和活性氧积累。更重要的是，4-PBA也完全逆转了沉默IFI6所诱导的ICD效应（包括CRT膜暴露、ATP和HMGB1释放的减少）以及放射增敏效应（细胞存活率恢复，凋亡率下降）。这一结果从反面证实，沉默IFI6正是通过激活内质网应激通路，来诱导ICD并增强放射敏感性的。
结论与讨论
本研究首次揭示了IFI6在TNBC放射抵抗中的关键作用及其分子机制。研究结论表明，IFI6是TNBC细胞抵抗放疗损伤的重要保护因子。当IFI6被沉默后，TNBC细胞失去了这种保护，导致内质网应激（ERS）被过度激活，进而引发活性氧（ROS）的大量积累。这种强烈的应激信号最终触发了免疫原性细胞死亡（ICD），使肿瘤细胞在死亡的同时释放出“危险信号”，从而增强了放疗的杀伤效果。
这项研究的意义重大。首先，它明确了IFI6是TNBC放射抵抗的一个新的分子标志物和潜在的治疗靶点。其次，它揭示了通过靶向IFI6来诱导ICD，是克服TNBC放疗抵抗的一种有效策略。这为开发新的放疗增敏剂提供了理论依据。例如，未来可以研发针对IFI6的小分子抑制剂，或者将其与免疫检查点抑制剂联合使用，有望为TNBC患者带来更有效的治疗选择。
