《Cell Death & Disease》：CRX is an intrinsic suppressor of epithelial?mesenchymal transition in retinal pigment epithelial cells: a promising therapeutic avenue for subretinal fibrosis
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本研究针对湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）中视网膜下纤维化（SF）形成的难题，聚焦于视网膜色素上皮（RPE）细胞上皮-间质转化（EMT）的关键病理环节。研究人员发现并证实了光感受器关键转录因子CRX在RPE细胞中的内源性表达，并揭示其在Hippo/YAP1与TGF-β1信号协同抑制下，通过上调PPP2R2B表达来抑制EMT的新机制。体内实验进一步验证了CRX过表达可有效减轻激光诱导的小鼠脉络膜新生血管（CNV）模型中的纤维化形成。该研究为湿性AMD的抗纤维化治疗提供了新的靶点和策略。
随着年龄的增长，一种名为年龄相关性黄斑变性（AMD）的眼病成为老年人视力丧失的主要原因之一。其中，湿性AMD的特征是异常的脉络膜血管生长（即脉络膜新生血管，CNV），这些脆弱的新生血管容易渗漏和出血，最终在视网膜下形成瘢痕组织，也就是视网膜下纤维化（SF）。这个纤维化瘢痕会对感光细胞造成不可逆的损伤，导致中心视力永久性丧失。尽管抗血管内皮生长因子（VEGF）药物能有效抑制血管渗漏，但对于已经形成的SF却束手无策，因此，寻找阻止SF形成的新策略是眼科领域亟待解决的难题。
在SF的形成过程中，视网膜色素上皮（RPE）细胞扮演了关键角色。RPE层是位于视网膜神经层和脉络膜之间的一层重要细胞，负责维持光感受器的健康。在病理刺激下，RPE细胞会经历一个称为上皮-间质转化（EMT）的过程，即从具有极性的、相互紧密连接的上皮细胞，转变为具有迁移和增殖能力的、类似成纤维细胞的间质细胞。这些转化后的细胞（肌成纤维细胞）是产生过量细胞外基质、形成纤维瘢痕的主力军。因此，抑制RPE细胞的EMT被认为是防治SF的核心策略。目前，已有研究揭示了多条促进EMT的信号通路，如转化生长因子-β（TGF-β）、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）和Hippo/YAP通路。然而，一个根本性问题尚不清楚：RPE细胞内部是否存在能够抵抗EMT、维持其上皮状态的内源性“刹车”机制？发现这样的内源性抑制因子，将为开发全新的治疗方法提供关键靶点。
有趣的是，研究人员在培养干细胞来源的RPE细胞时观察到一个现象：这些细胞在多次传代后，依然能够从分散的状态重新聚集并恢复成典型的上皮形态。这暗示细胞内部存在强大的自我调控机制，能够在EMT（传代导致的细胞连接破坏）后，精确地启动反向的间质-上皮转化（MET），使细胞“改邪归正”。基于此线索，研究团队将目光投向了一个意想不到的分子——光感受器关键转录因子锥杆同源框基因（Cone-rod homeobox-containing gene, CRX）。CRX长期以来被认为是调控光感受器细胞发育和功能的核心转录因子，其在RPE细胞中的表达和功能存在争议。那么，CRX是否就是RPE细胞中那个抵抗EMT的内源性守护者？它又是如何被调控并发挥作用的？为了回答这些问题，来自同济大学的研究团队在《Cell Death & Disease》上发表了他们的最新研究成果。
为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术。他们利用人胚胎干细胞来源的RPE细胞（ESC-RPE）和诱导多能干细胞来源的RPE细胞（iPSC-RPE）作为体外研究模型。通过细胞传代和划痕实验模拟细胞连接破坏，并结合TGF-β1处理来模拟纤维化微环境。在分子机制层面，运用了染色质免疫共沉淀（ChIP）、RNA测序（RNA-seq）、蛋白质印迹（Western blotting）、免疫荧光染色、共免疫沉淀（Co-IP）等技术来探索CRX的上游调控和下游效应分子。在体内验证方面，建立了成熟的激光诱导的小鼠CNV模型，并通过视网膜下注射携带CRX基因的慢病毒、马松三色染色（Masson staining）和免疫组织化学等方法评估CRX过表达对SF的抑制作用。
研究结果
1. CRX在RPE细胞中的表达确认
研究人员首先对已发表的人视网膜和RPE/脉络膜单细胞核RNA测序数据进行了分析。结果明确显示，在RPE细胞（由RPE65标记）中，有高达53.54%的细胞可以检测到CRX的表达。此外，蛋白质印迹结果证实CRX蛋白在ESC-RPE和iPSC-RPE细胞中均有表达。对已发表的基因芯片数据的分析也表明，在RPE-脉络膜组织中能检测到CRX的表达。这些证据共同证实了CRX在RPE细胞中存在内源性表达。
2. CRX的表达和核转位在RPE细胞传代过程中发生动态变化
为了模拟体内RPE细胞连接破坏的情景，研究人员对ESC-RPE细胞进行了传代培养。他们发现，在传代第一天，随着细胞间连接的破坏，细胞表现出EMT的早期特征（如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达升高），此时CRX的表达水平下降，但其蛋白却大量进入细胞核（核滞留率超过75%）。随后几天，随着细胞重新建立紧密连接（通过ZO-1染色显示）并恢复上皮形态（MET过程），CRX的总体表达水平逐渐回升，但其核内的比例却逐渐降低。这表明CRX的表达和核质穿梭与RPE细胞的EMT/MET过程密切相关。
3. β-连环蛋白/TCF7介导YAP1对CRX表达的抑制作用
细胞连接破坏会抑制Hippo信号通路，导致其下游效应分子YAP1去磷酸化并进入细胞核，进而促进EMT。本研究发现，抑制Hippo通路（使用抑制剂XMU-MP-1）会促使YAP1入核，并显著下调CRX的表达。然而，染色质免疫共沉淀实验表明YAP1及其伙伴TEAD并不能直接结合CRX的启动子区。进一步的机制探索发现，YAP1可以与β-连环蛋白结合，并促进其进入细胞核。在核内，β-连环蛋白与转录因子TCF7形成复合物，该复合物能够直接结合到CRX基因的启动子区域，从而抑制CRX的转录。当使用β-连环蛋白抑制剂MSAB或敲低TCF7时，CRX的表达水平则显著上升。这揭示了Hippo/YAP1通路通过β-连环蛋白/TCF7间接抑制CRX表达的分子桥梁。
4. CRX抑制RPE细胞的EMT
为了验证CRX的功能，研究人员在ESC-RPE细胞中过表达了CRX。结果显示，在常规传代或TGF-β1诱导的EMT模型中，CRX过表达均能有效抑制EMT，表现为上皮标志物（如E-钙黏蛋白和闭合蛋白）表达上调，而同质标志物（如α-SMA和波形蛋白）表达下调。同时，研究发现TGF-β1诱导的EMT和CRX表达下调也部分依赖于β-连环蛋白的激活。一个重要的发现是，在RPE细胞中过表达CRX并不会导致其向光感受器细胞转分化，反而能上调RPE细胞特异性基因（如RPE65）的表达，这可能有助于增强RPE细胞的生理功能。
5. PPP2R2B介导CRX对TGF-β1诱导的EMT的抑制作用
为了阐明CRX抑制EMT的下游机制，研究人员进行了RNA测序分析，并筛选出9个与EMT相关的CRX潜在靶基因。其中，蛋白磷酸酶2A调节亚基B家族成员PPP2R2B的表达变化最为显著。进一步的实验证实，CRX可以直接结合PPP2R2B的启动子并促进其表达。功能上，过表达PPP2R2B可以部分抵消TGF-β1诱导的EMT效应；而在CRX过表达的细胞中敲低PPP2R2B，则会削弱CRX对EMT的抑制作用。划痕实验也表明，PPP2R2B的敲低逆转了CRX过表达对细胞迁移的抑制。这些结果说明，PPP2R2B是CRX发挥抗EMT作用的关键下游效应分子。
6. CRX减轻激光诱导的小鼠CNV和视网膜下纤维化
在激光诱导的小鼠CNV模型中，研究人员观察到在损伤灶邻近区域的RPE细胞核内，CRX和YAP1均有表达，这与体外实验中“慢迁移细胞”的状态相似，提示CRX可能在此发挥抑制EMT的作用。更重要的是，通过视网膜下注射慢病毒在RPE细胞中过表达CRX后，与空载体对照组相比，过表达CRX能显著减小激光灶区域的胶原沉积面积和α-SMA阳性区域，表明SF的形成受到了有效抑制。这为CRX的体内治疗潜力提供了直接证据。
结论与讨论
本研究首次系统地证实了CRX是RPE细胞中一个重要的内源性EMT抑制因子。研究描绘了一条清晰的信号轴：在湿性AMD的病理环境下，Hippo/YAP1信号通路的失活和TGF-β1信号的激活协同作用，共同促进了β-连环蛋白的核转位。核内的β-连环蛋白与TCF7结合，抑制了CRX的转录表达。而CRX的下调则削弱了其对下游靶基因PPP2R2B的促进作用，最终解除了对EMT的刹车，导致SF的形成。
这项研究的重大意义在于：
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理论创新：发现了传统光感受器转录因子CRX在RPE细胞中的新功能，揭示了其作为EMT内源性抑制因子的全新角色，深化了对眼内纤维化发病机制的理解。
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机制深入：阐明了Hippo/YAP1、TGF-β和Wnt/β-连环蛋白这几条重要的促纤维化通路如何交叉对话，汇聚于CRX这一节点进行协同调控，提供了更全面的病理信号网络视图。
- 3.
治疗靶点：鉴定出CRX及其下游分子PPP2R2B作为干预SF形成的潜在新靶点，为开发针对湿性AMD晚期纤维化并发症的疗法提供了新思路。通过增强内源性保护机制来对抗疾病，可能比单纯抑制促病通路更具持久性和安全性。
- 4.
应用前景：该策略不仅适用于湿性AMD，对于其他以RPE细胞EMT为关键病理过程的眼病，如增殖性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变和遗传性视网膜变性等，也具有重要的借鉴意义。
当然，研究也留下了一些有待探索的问题，例如精确调控CRX核转位的信号通路尚不清楚，TGF-β经典Smad通路是否参与CRX调控，以及在更接近人类疾病状态的老年动物模型中验证CRX疗效等。尽管如此，本研究无疑为战胜视网膜下纤维化这一难题点亮了一盏新的指路明灯，开启了通过调动细胞自身防御力量来治疗眼内纤维化疾病的新篇章。
