《Journal of Diabetes Research》：Identification and Verification of Biomarkers Related to Polyamine Metabolism in Diabetic Nephropathy
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本综述创新性地聚焦于多胺代谢（PM）在糖尿病肾病（DN）中的作用，通过生物信息学分析与实验验证，首次鉴定出KAZALD1、GLCE和RPRD1B三个关键基因作为DN的潜在诊断标志物（AUC>0.8）。研究揭示了这些标志物与支链氨基酸降解、细胞因子-细胞因子受体相互作用及过氧化物酶体等通路密切相关，并深入探讨了其与免疫细胞浸润（如CD8+T细胞、M1巨噬细胞）的调控网络，为DN的早期诊断和靶向治疗提供了新的理论依据和候选靶点。
摘要
糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糖尿病最常见且严重的微血管并发症之一，是全球终末期肾病（End-Stage Renal Disease, ESRD）的主要原因。多胺（Polyamines），包括精胺（spermine）、亚精胺（spermidine, SPD）和腐胺（putrescine），是广泛存在于生物体内的多价阳离子，对细胞增殖、凋亡和基因调控等过程具有重要作用。多胺代谢（Polyamine Metabolism, PM）包括生物合成、分解代谢和转运。研究表明，多胺的降解产物会加重慢性肾病患者的肾损伤，但多胺代谢相关基因（PM-RGs）在DN中的具体作用尚不清楚。本研究旨在阐明PM-RGs与DN之间的潜在关联。
1. 引言
糖尿病已成为威胁本世纪人类健康的重大医学问题，其全球患病率在过去几十年中显著增加。DN主要表现为肾微血管和肾小球损伤，导致异常蛋白尿和滤过功能异常，最终可能引发肾衰竭。DN的发病机制复杂，目前常规的血糖和血压控制疗法无法有效阻止其向ESRD进展。因此，深入研究DN的发病机制并确定潜在的治疗靶点，对于开发新的治疗策略至关重要。本研究利用DN患者外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的转录组数据集，对PM相关基因进行功能注释、富集分析和互作网络构建，旨在识别与DN中PM相关的潜在生物标志物和关键通路，为疾病的早期诊断和精准治疗提供理论依据。
2. 材料与方法
从公共数据库获取DN相关数据集（GSE142153和GSE185011）以及59个PM-RGs。通过差异表达分析、机器学习算法（LASSO和Boruta）和受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线筛选生物标志物。随后进行富集分析、免疫浸润分析和药物预测。最后，通过逆转录定量聚合酶链反应（Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR）和免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）在临床样本中验证生物标志物的表达。
3. 结果
3.1. 交集基因与细胞凋亡相关
GSE142153数据集的基因集与59个PM-RGs共有56个交集PM-RGs。基于这些基因，所有样本被成功分为两个不同的簇。差异表达分析共识别出1445个DN组与对照组之间的差异表达基因1（Differentially Expressed Gene 1, DEG 1）以及1812个簇间差异表达基因2（DEG 2）。取交集后获得524个交集基因。富集分析显示，这些交集基因显著富集于31个基因本体（Gene Ontology, GO）条目和7个京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路，包括细胞因子产生的正调控、氧转运、脂质与动脉粥样硬化、MAPK信号通路和细胞凋亡（apoptosis）等。蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络分析显示，IL-1B和IL-6与其他基因的关联最多。
3.2. KAZALD1、GLCE和RPRD1B被鉴定为DN的生物标志物
在验证数据集GSE185011中，共识别出1593个DN与对照组间的差异表达基因3（DEG 3）。将DEG 1和DEG 3中共同上调和共同下调的基因分别与524个交集基因取交集，联合后获得8个候选基因。随后应用LASSO回归和Boruta算法进行特征基因筛选。LASSO模型（lambda.min = 0.076）筛选出3个特征基因（KAZALD1, GLCE, RPRD1B），Boruta算法筛选出5个特征基因（KAZALD1, GLCE, RPRD1B, ZNF250, MED21）。取交集后，KAZALD1、GLCE和RPRD1B被共同确定为候选生物标志物。ROC曲线分析显示，这三个标志物在GSE142153和GSE185011数据集中的曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）均大于0.8，显示出强大的DN诊断能力，因此被确定为最终的生物标志物。
3.3. 生物标志物参与多种生物学通路
基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）结果表明，所有生物标志物均显著富集于缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，细胞因子-细胞因子受体相互作用，以及过氧化物酶体（peroxisome）相关通路。此外，通过SPEED2数据库分析上游通路活性发现，生物标志物在缺氧（hypoxia）、Notch和p53等上游活性通路中表达上调，而在雌激素（estrogen）、TGF-β等通路中表达下调，尤其在雌激素通路中的下调趋势显著。
3.4. 免疫细胞与生物标志物存在相关性
利用xCell算法评估GSE142153数据集中DN组和对照组的免疫浸润水平，共分析了64种免疫细胞。结果显示，两组间有19种免疫细胞的浸润水平存在显著差异，包括脂肪细胞、B细胞和初始CD4 T细胞（naive CD4 T cells）等。相关性分析发现，KAZALD1和RPRD1B的表达与初始CD8 T细胞（naive CD8 T cells）、M1巨噬细胞（M1 macrophages）等呈正相关，而与CD8 T细胞、B细胞、T辅助细胞（T helper cells）等呈负相关。相比之下，GLCE与免疫细胞的相关性与其他两个生物标志物呈现相反的趋势。
3.5. 生物标志物受多个分子共同调控
构建了一个长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）-微小RNA（microRNA, miRNA）-生物标志物调控网络，该网络包含3个生物标志物、30个miRNAs和27个lncRNAs。生物标志物的调控涉及多个分子的协同作用，例如，SNHG12、NEAT1、LINC02595、SNHG16和AL109615.3通过hsa-miR-218-5p共同参与调控GLCE的表达。基于三个生物标志物，预测了11种潜在靶向药物，包括苯并芘（benzopyrene）、双酚A（Bisphenol A）、炔雌醇（ethinyl estradiol）等。值得注意的是，双酚A可同时靶向所有三个生物标志物，而苯并芘和炔雌醇可共同靶向KAZALD1和GLCE。
3.6. 生物标志物表达的验证
在GSE142153和GSE185011数据集中，KAZALD1和RPRD1B在DN组中表达显著上调，而GLCE在DN组中显著下调。通过临床样本（5例对照和5例DN患者的PBMCs及肾组织）进行进一步验证。RT-qPCR和IHC结果证实，KAZALD1和RPRD1B在临床DN样本中显著高表达，与数据集结果一致。然而，GLCE的表达模式与数据集中的趋势不完全相符，其在肾组织中的验证结果与生物信息学预测存在差异，这可能与组织特异性、疾病异质性等因素有关。
4. 讨论
本研究通过生物信息学分析结合实验验证，首次鉴定出KAZALD1、GLCE和RPRD1B作为与PM相关的DN潜在诊断生物标志物。KAZALD1是胰岛素样生长因子结合蛋白（Insulin-like Growth Factor-Binding Protein, IGFBP）超家族成员，在肾缺血再灌注损伤（Ischemia-Reperfusion Injury, IRI）中已被提议作为早期识别标志物。GLCE是硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）合成的关键酶，DN患者肾小球基底膜中HS的减少与蛋白尿负相关，提示GLCE可能通过影响HS代谢参与DN进程。RPRD1B（亦称CREPT）是一种细胞周期相关蛋白，可通过调控细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的转录影响肾系膜细胞增殖，从而参与肾损伤。
功能富集分析表明，这些标志物关联的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路在DN组更为活跃，提示PM可能通过参与支链氨基酸（Branched-Chain Amino Acids, BCAAs）降解影响DN发生。细胞因子-细胞因子受体相互作用及过氧化物酶体通路也已被证实参与DN病理过程。上游通路活性分析提示生物标志物可能参与氧化应激反应。
免疫浸润分析揭示了生物标志物与免疫微环境的密切关联。KAZALD1和RPRD1B与初始CD8 T细胞、M1巨噬细胞等的正相关，以及与CD8 T细胞、B细胞等的负相关，提示PM可能通过调节免疫细胞功能参与DN进展。例如，多胺亚精胺（SPD）可增强CD8+T细胞的脂肪酸氧化（Fatty Acid Oxidation, FAO）活性和细胞毒性功能，而精胺（spermine）则具有竞争性抑制作用。M1巨噬细胞的促炎极化在DN肾损伤和纤维化中起推动作用，而多胺参与调节M1巨噬细胞的功能和极化。
药物预测为DN治疗提供了新的思路，虽然如双酚A等化合物的毒性需谨慎评估，但其作用机制提示了调控相关通路的可能性。
本研究的局限性包括样本量有限、潜在批次效应、因果关系未证实、GLCE表达不一致以及缺乏功能性实验验证。未来需要在更大规模队列中验证，并利用细胞和动物实验深入探讨其具体机制。
5. 结论
本研究确定KAZALD1、GLCE和RPRD1B为DN的潜在诊断生物标志物，具有强大的诊断性能。这些标志物参与细胞凋亡、免疫调节和代谢过程等关键生物学通路，与DN免疫微环境塑造密切相关。调控网络分析揭示了其受lncRNA、miRNA和小分子化合物的复杂调控。实验验证证实了KAZALD1和RPRD1B在DN样本中的上调，而GLCE的表达模式需进一步研究。这些发现为理解DN发病机制提供了新见解，并为诊断和治疗提供了有希望的途径。
