《Cell Proliferation》：Hypoxia Exacerbates Periapical Periodontitis-Associated Pathological Bone Loss via the Hypoxia-Inducible Factor-2α-Calmodulin-Dependent Protein Kinase IV Axis
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本研究揭示了缺氧（Hypoxia）作为关键环境风险因素，通过缺氧诱导因子-2α（HIF-2α）直接调控钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV（CAMK4）转录，从而在根尖周炎（Periapical Periodontitis）中放大破骨细胞（Osteoclast）分化和骨吸收的分子机制。研究结合动物模型（C57BL/6N小鼠）、显微计算机断层扫描（micro-CT）、切割标签测序（CUT&Tag）等技术，证实缺氧暴露通过HIF-2α-CAMK4轴加剧炎症性骨破坏，为缺氧相关口腔骨疾病的靶向治疗提供了新思路。
引言
根尖周炎是一种常见的口腔炎症性骨破坏疾病，其核心病理是宿主对根管内感染的免疫应答失衡，导致破骨细胞异常活化和进行性牙槽骨吸收。流行病学研究表明，暴露于特定环境（如高海拔）的人群患根尖周炎的风险较高，提示缺氧暴露可能是加剧疾病进展的临床相关环境应激源。然而，直接实验证据和分子机制尚不清楚。细胞对缺氧的适应性反应主要由缺氧诱导因子（Hypoxia-Inducible Factor, HIF）家族转录因子介导，其中HIF-1α和HIF-2α是研究最广泛的亚型。尽管HIF信号在多种生理和炎症环境中调控破骨细胞分化和骨吸收，但HIF-2α在缺氧驱动的炎症性骨丢失中的作用尚不明确。本研究通过建立缺氧暴露下的根尖周炎动物模型，结合CUT&Tag测序技术，旨在阐明HIF-2α在缺氧加剧根尖周炎骨破坏中的关键作用及其下游机制。
材料与方法
所有动物实验均遵循首都医科大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南，并获得批准（伦理批准号：AEEI-2025-225）。使用8周龄健康雄性C57BL/6N小鼠，通过暴露上颌第一磨牙牙髓并应用脂多糖（LPS）建立根尖周炎模型。缺氧模型通过动物气体控制系统维持10%氧浓度模拟。局部注射携带shRNA靶向Hif2a的腺相关病毒（AAV9）载体进行基因敲低。采用显微计算机断层扫描（micro-CT）量化根尖区骨破坏体积，组织学染色（H&E和TRAP）和免疫荧光分析评估炎症细胞浸润和破骨细胞活性。血清细胞因子（IL-1β和TNF-α）水平通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测。体外实验从小鼠股骨和胫骨分离骨髓源性巨噬细胞（BMM），在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导下，于3% O2缺氧条件下进行破骨细胞分化。采用蛋白质印迹（Western blot）、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和CUT&Tag测序分析HIF-2α及其靶基因表达。数据以均值±标准误表示，使用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析。
结果
缺氧暴露加剧根尖周炎小鼠的牙槽骨吸收和系统性炎症反应
与常氧根尖周炎（NAP）组相比，缺氧根尖周炎（HAP）组小鼠根尖区炎症细胞浸润更显著，牙槽骨吸收更严重。micro-CT显示HAP组根尖低密度病变体积显著大于NAP组。血清IL-1β和TNF-α水平在HAP组显著升高，表明缺氧暴露加剧了局部骨破坏并伴随系统性炎症反应。
缺氧增强破骨细胞分化与功能成熟
TRAP染色和NFATc1免疫荧光显示，HAP组破骨细胞数量和活性显著高于NAP组。体外实验表明，缺氧单独处理（Hy组）或LPS单独处理（Ctrl+LPS组）均可上调破骨细胞分化相关基因（Nfatc1、Ctsk、Trap）表达，而缺氧联合LPS（Hy+LPS组）产生协同效应，形成更多TRAP阳性多核破骨细胞和更完整的F-actin环。
HIF-2α持续激活并在缺氧增强的破骨细胞分化中起主导作用
蛋白质印迹显示，缺氧条件下HIF-1α蛋白水平在分化第1天达峰后下降，而HIF-2α蛋白随时间推移持续升高，尤其在缺氧联合LPS刺激下更为显著。免疫荧光证实HAP组根尖区HIF-2α蛋白表达最丰富。使用HIF-2α特异性抑制剂PT2399处理后，NFATc1和CTSK蛋白表达显著降低，表明HIF-2α是缺氧增强破骨细胞分化的关键分子。
局部敲低HIF-2α有效缓解缺氧加剧的骨破坏
局部注射AAV-sh-Hif2a病毒可有效敲低根尖区HIF-2α表达。micro-CT和组织学分析显示，缺氧条件下敲低HIF-2α显著减少骨破坏体积、炎症浸润和破骨细胞数量，而在常氧条件下敲低无明显影响，提示HIF-2α在病理性缺氧骨吸收中起主导作用。
HIF-2α通过调控Camk4转录介导破骨细胞分化
HIF-2α CUT&Tag测序显示，缺氧条件下HIF-2α结合峰显著富集于“破骨细胞发育调控”通路。Venn图交叉分析筛选出Camk4、Tmem64和Pafah1b1等候选靶基因。IGV可视化显示HIF-2α在Camk4启动子区有特异性结合峰。PT2399处理显著下调Camk4 mRNA表达，而Tmem64和Pafah1b1无显著变化。免疫荧光证实CAMK4蛋白表达模式与HIF-2α一致，在HAP组最高，敲低HIF-2α后降低。结果表明HIF-2α通过直接结合Camk4启动子激活其转录，进而促进破骨细胞分化。
讨论
本研究通过模拟临床缺氧环境，揭示缺氧暴露作为“协同放大器”通过HIF-2α-CAMK4轴加剧根尖周炎骨破坏的机制。HIF-2α的持续激活及其对Camk4的直接转录调控是这一过程的核心。该发现为理解“环境-宿主-微生物”交互作用提供了新视角，提示针对HIF-2α或下游通路的局部干预可能成为缺氧相关炎症性骨疾病的辅助治疗策略。未来需进一步探讨缺氧对骨免疫微环境中其他细胞（如成骨细胞、T细胞）的影响，以及性别差异和微生物组变化在其中的作用。
结论
缺氧暴露通过HIF-2α-CAMK4轴显著加剧根尖周炎病理性骨丢失。该轴作为“协同放大器”增强炎症信号诱导的破骨细胞反应。靶向HIF-2α或其下游通路可能为缺氧易感人群的口腔及系统炎症性骨病提供新的治疗策略，并推动“低氧口腔医学”这一新兴交叉领域的发展。
