评估方法对单核细胞增生李斯特菌季铵化合物敏感性判定的影响研究

《The Microbe》：Influence of the Evaluation Method on the Assessment of the Susceptibility of Listeria monocytogenes to Quaternary Ammonium Compounds

本研究针对食品加工环境中单核细胞增生李斯特菌对季铵类消毒剂敏感性评估缺乏标准化方法的问题，通过比较琼脂扩散法、悬浮挑战试验和不锈钢表面挑战试验，建立了基于抑制圈直径的敏感性分类标准，为食品工业消毒剂有效性监测提供了快速可靠的筛查工具。

　　

在食品工业的战场上，消毒剂是抵御微生物入侵的重要防线。其中，季铵化合物（QACs）因其广谱抗菌特性，成为食品加工环境中最常用的化学消毒剂之一。然而，随着这类消毒剂的广泛使用，一个新的威胁悄然浮现——微生物耐药性。单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）作为一种重要的食源性病原体，不仅能在冷藏温度下生长，还能在加工设备表面形成生物膜，对消毒剂产生耐受性。更令人担忧的是，研究发现李斯特菌对QACs的耐药性可能与抗生素耐药性存在关联，这给公共卫生安全带来了双重挑战。

目前，食品行业通常采用悬浮挑战试验和表面挑战试验来评估消毒剂效果。虽然这些方法能模拟实际应用场景，但操作复杂、耗时较长，不适用于大规模菌株的快速筛查。而传统的琼脂扩散法（包括纸片法和打孔法）虽被广泛应用于抗生素敏感性测试，但由于缺乏标准化的判读标准，在消毒剂评估领域的应用一直存在争议。如何建立一种快速、可靠的筛查方法，以及如何解读实验结果，成为食品微生物学家亟待解决的难题。

在这项发表于《The Microbe》的研究中，墨西哥克雷塔罗自治大学的研究团队开展了一项系统研究，旨在比较不同方法对单核细胞增生李斯特菌QACs敏感性的评估效果，并建立科学的分类标准。研究人员从冷冻蔬菜、奶酪、鳄梨和西兰花加工环境中共收集了29株李斯特菌菌株（包括一株标准菌株ATCC 19115），通过抗生素敏感性测试和QACs耐药基因（bcrABC和qacH）筛查对其进行了全面表征。

关键技术方法包括：采用Kirby-Bauer法进行12种抗生素的敏感性测试；通过终点PCR检测bcrABC和qacH耐药基因；使用琼脂扩散法（打孔法和纸片法）评估对QACs（50-1000 ppm）的敏感性；通过悬浮挑战试验（200 ppm/30秒）和不锈钢表面挑战试验（200/500 ppm，30秒/2分钟）评估消毒效果；利用K-means聚类分析建立基于抑制圈直径的敏感性分类标准。

研究结果显示，琼脂扩散法中，打孔法产生的抑菌圈直径显著大于纸片法，两种方法均表现出浓度依赖性效应。基于500 ppm QACs的K-means聚类分析，研究人员提出了创新性的敏感性分类标准：打孔法中，抑菌圈直径≥21 mm为敏感，16-21 mm为中介，<16 mm为耐药；纸片法中，相应标准为≥17 mm、12-17 mm和<12 mm。

基因检测发现，73.9%的冷冻蔬菜加工环境分离株携带bcrABC基因，8.7%携带qacH基因，而其他来源菌株未检测到这些耐药基因。值得注意的是，冷冻蔬菜环境分离株对QACs表现出更高的耐药性，95.7%的菌株被分类为耐药。

挑战试验结果显示，悬浮试验中200 ppm QACs作用30秒即可完全灭活所有测试菌株（>9 log减少）。然而，在不锈钢表面试验中，即使使用500 ppm作用2分钟，最大菌群减少量也仅为4.8 log CFU/cm²，未达到5 log的工业消毒标准。相关性分析表明，琼脂扩散法与不锈钢表面试验结果呈负相关（ρ = -0.4），即抑菌圈直径越大，表面试验中存活菌群越少。

研究结论表明，琼脂扩散法可作为监测李斯特菌对QACs敏感性的快速筛查工具，而不锈钢表面挑战试验更能真实反映食品加工环境中的实际消毒效果。冷冻蔬菜加工环境分离株对QACs的耐药性较高，提示该环境可能存在消毒程序不当或QACs过度使用的情况。研究人员建立的基于统计分析的敏感性分类标准，为食品行业消毒剂有效性评估提供了实用参考。

这项研究的重要意义在于首次系统比较了不同方法评估李斯特菌对QACs敏感性的差异，并建立了基于统计分析的分类标准。研究结果强调，食品加工环境分离株的耐药性监测对于制定有效消毒策略至关重要，而表面挑战试验应作为消毒剂效果验证的必要环节。这一研究成果为食品企业优化消毒程序、控制李斯特菌污染提供了科学依据，对保障食品安全和公共卫生具有重要意义。