《Microchemical Journal》：Liquid crystal biosensor with aptamer recognition for highly sensitive and quantitative norfloxacin detection via whispering gallery mode
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诺氟沙星检测利用适配体修饰的液晶微激光器，通过 whispering gallery 模式共振变化实现高灵敏度（0.3 ng/mL）定量分析，在土壤样本中验证有效性且无需荧光标记。
安佩尧|李梦晓|张珊珊|曹振琪|于淼|黄唐城|王铎|李月|沈仁胜|杨鑫|任俊|吴振林
大连工业大学光电工程与仪器科学学院，中国大连116024
摘要
氟喹诺酮类抗生素诺氟沙星具有抗菌特性和高效抑制细菌DNA复制的能力。由于其强烈的DNA解旋酶结合亲和力，该化合物化学性质稳定，在环境介质中的生物降解性较低。长期使用或排放可能导致微生物群落中抗生素抗性基因的富集，从而引发持续性污染。本文报道了一种基于适配体识别的向列液晶（LC）微激光器，并探讨了其在土壤中检测诺氟沙星的超高灵敏度应用。通过利用功能化有特定适配体的LC微滴中的回音廊模式（WGM）共振，实现了诺氟沙星的快速、实时和定量监测。通过共振模拟和尺寸依赖性实验，证明了LC微激光器作为WGM微谐振器的可行性。CTAB和DNA适配体的最佳浓度分别为1 μM和100 nM，这使LC微滴从径向配置转变为双极配置。所开发的诺氟沙星传感器具有高灵敏度，检测限为0.3 ng/mL，比偏振光学显微镜（POM）方法的检测限低一个数量级。此外，在土壤样品中成功检测到不同浓度的诺氟沙星，凸显了其在环境监测中的实际应用价值。基于适配体的WGM-LC微激光器为诺氟沙星检测提供了一种高灵敏度的方法。该激光识别探针无需荧光或显色标记，为快速、实时和定量生物传感提供了显著优势。这一平台有望扩展到其他药物、蛋白质或环境污染物的超高灵敏度检测，特别适合集成到微流控设备中，用于现场环境监测和公共卫生风险评估。
引言
抗生素的发现和发展深刻改变了医疗保健系统的结构和功能。数十年来，它们的持续应用在预防和控制传染病方面发挥了重要作用[1]。诺氟沙星（NOX）是首个发现的氟喹诺酮类抗生素[2]。作为一种广谱抗菌药物，诺氟沙星因高效抑制细菌DNA复制而在医学和兽医领域得到广泛应用[3,4]。然而，过量摄入诺氟沙星可能导致一系列不良反应，如胃肠道不适、肝肾损伤和抗生素耐药性。一些国家已为不同动物源性食品中的诺氟沙星残留量制定了最大限量标准，以有效监测食品中的抗生素水平[5,6]。然而，大多数抗生素不可生物降解，即使其浓度很低（ng/L），也可能导致抗菌耐药性，这是一个严重的环境问题。因此，检测诺氟沙星残留是否符合安全标准对于确保环境安全和消费者健康至关重要。目前，包括电化学方法、荧光光谱[7,8]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[9]、高效液相色谱（HPLC）[10,11]在内的多种分析方法被广泛用于牛奶和水样中诺氟沙星的检测。
液晶（LC）作为一种独特的功能材料，由于其优异的生物相容性、高灵敏度和灵活性，逐渐被用于开发化学和生物传感器[12,13]。LC被用作信号放大器，用于检测和报告LC/水界面的微小分子事件和外部扰动。研究人员通常使用偏振光学显微镜（POM）来识别LC分子的变化。POM观测技术已成功用于检测表面活性剂、脂质[14]、蒸汽[15]、蛋白质[16,17,18]和合成聚合物[19]。然而，POM检测方法依赖于主观视觉观察，难以实现定量和高精度检测。这一限制成为大多数基于LC的传感器应用的主要障碍。最近的研究表明，光谱检测目标分子是一种更敏感的方法。例如，刘等人提出了一种LC放大的光流控传感器，用于检测牛血清白蛋白，检测限达到1 fM[20]；杨等人开发了一种基于微气泡的光学条形码，可实现高精度和宽温度范围检测[21]。
然而，微气泡配置容易受到周围环境因素的影响。例如，产生微气泡腔体复杂且难以保证一致性。微气泡腔体对环境干扰非常敏感。微气泡腔体通常通过光纤锥体与WGM激光耦合，但这种耦合方法容易受到距离和对准误差的影响，从而限制了耦合效率。掺杂染料的LC滴可以支持WGM激光并作为传感探针。这种新的检测方法有效克服了传统POM方法的局限性。
核酸适配体是通过指数富集（SELEX）技术系统进化得到的短链单链寡核苷酸（DNA或RNA）[22]。适配体能够以高灵敏度和强亲和力特异性结合各种目标分子，包括蛋白质、细胞、小分子和细菌[23]。在适配体传感器中，检测机制由目标分子结合引发的构象变化触发，例如目标结合后形成G-四链结构[24,25]。这些特性使适配体在各种生物传感器应用中成为极具吸引力的分子识别探针。近年来，由于适配体的优异目标识别和结合能力，基于适配体的LC生物传感器的应用得到了快速发展，显著提高了传感器的选择性[26,27,28]。将LC材料与适配体结合已成为开发高特异性生物传感平台的关键方法。
在这项工作中，构建了一种创新的基于液晶的传感平台，用于检测诺氟沙星（NOX），采用DNA适配体作为分子识别元件。LC微滴作为传感元件和样品池，用于分析微量样品。表面活性剂CTAB通过影响界面取向来控制液滴中液晶的排列。当诺氟沙星与其特定的DNA适配体结合时，这种相互作用会破坏液晶分子的垂直排列，最终实现5CB微激光从双极配置到径向配置的定性检测。通过模拟和实验的结合，证明了使用LC微滴作为光学微谐振器的可行性。通过WGM共振和5CB分子的协同放大效应，界面观察到的生物反应响应显著增强，实现了0.3 ng/mL的诺氟沙星检测限。通过与POM方法的比较，验证了WGM光谱分析方法的定量、有效性和灵敏度。同时，该传感器也在土壤样品中得到了验证。
工作原理
当光在WGM微激光器表面附近的赤道区域传播时，由于微腔与周围介质之间的折射率（RI）差异，会发生全内反射。这种现象使光在微谐振器内部反复循环。WGM微激光器通过光学微腔的全内反射和驻波形成提供了高度限制的光场。
微激光发射
图2(a)展示了活性模式LC微滴的激光发射光学系统。考虑到使用532 nm泵浦光源以及染料在LC材料中的良好溶解性和稳定性，选择了DCM(4-(二氰亚甲基)-2-甲基-6-(4-二甲基氨基苯乙烯基)-4H-吡喃)作为增益染料。泵浦光通过显微镜聚焦到LC微滴上。放置在PMMA基底上的PBS微滴作为形成LC的主要介质。
结论
本研究开发了一种高灵敏度的诺氟沙星生物传感器，采用DNA适配体作为目标识别探针，并结合基于LC的生物传感策略。DNA适配体与诺氟沙星的结合导致CTAB在LC/水界面重新分布，使LC分子在垂直方向上重新排列。结合回音廊模式（WGM）光谱学，这种变化使得能够检测到诺氟沙星。
材料和化学品
用于微腔改性的向列液晶4-氰基-4'-戊基联苯（5CB）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH = 7.4）购自Aladdin。DNA适配体的具体序列为5′-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-3′，由synbio Technologies合成。DNA适配体选自之前的报道[32]。用于特异性识别实验的诺氟沙星（NOX，≥98%）；阿莫西林
CRediT作者贡献声明
安佩尧：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。
李梦晓：方法学、研究。
张珊珊：数据整理。
曹振琪：撰写——审稿与编辑。
于淼：研究。
黄唐城：方法学。
王铎：方法学。
李月：研究。
沈仁胜：指导。
杨鑫：指导。
任俊：指导、项目管理。
吴振林：指导、项目管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了“中央高校基本科研业务费（DUT25YG256）”项目的资助。
