《Molecular Plant Pathology》：Secreted Glycoside Hydrolase BcGH61 From Botrytis cinerea Induces Cell Death by the Apoplastic Location and Triggers Intracellular Immune Perception
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本研究揭示了灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）分泌的糖苷水解酶BcGH61作为一种新型细胞死亡诱导蛋白（CDIP）的双重功能。该蛋白通过其完整的糖苷水解酶活性、保守的二硫键及特定结构域在质外体（apoplast）空间诱导植物细胞死亡，其毒性作用不依赖于经典的免疫共受体BAK1/SOBIR1。同时，BcGH61被鉴定为病原菌的关键毒力因子，其缺失突变体毒力显著减弱。研究进一步发现BcGH61与本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的过敏反应结合蛋白NbHrBP1直接互作，介导了细胞内免疫感知，但该过程不参与细胞死亡诱导。该研究为理解坏死性病原菌的致病机制及植物免疫识别策略提供了新的分子框架。
BcGH61的鉴定与分泌特性
研究团队从灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）中鉴定出一个新的植物细胞死亡诱导蛋白（CDIP），命名为BcGH61。该蛋白由bcgh61基因（Bcin09g06750）编码，包含一个保守的糖苷水解酶61（GH61）结构域。生物信息学分析预测其N端存在信号肽（SP），且无跨膜结构域，提示其为分泌蛋白。通过酵母信号肽捕获实验，研究人员证实了BcGH61信号肽的功能性，表明其能够介导蛋白的分泌。为了进一步验证其在植物细胞中的定位，研究者在烟草叶片中瞬时表达了全长BcGH61（BcGH61-GFP）及其信号肽缺失突变体（BcGH61ΔSP-GFP）。蛋白质印迹和共聚焦显微镜观察结果显示，全长BcGH61能够积累在质外体空间，而信号肽缺失突变体则滞留在细胞质和质膜上，这证实了BcGH61的分泌依赖于其信号肽，并在植物细胞中定位于质外体。
BcGH61诱导植物细胞死亡的能力
为了评估BcGH61诱导植物细胞死亡的能力，研究者在烟草叶片中瞬时表达了全长BcGH61及其信号肽缺失突变体。结果显示，表达全长BcGH61的叶片在72小时后出现了明显的细胞死亡症状，而表达信号肽缺失突变体或GFP对照的叶片则无此现象。蛋白质印迹分析证实了各蛋白的表达水平相当，表明BcGH61的细胞死亡诱导活性依赖于其质外体定位。为了进一步验证，研究者在大肠杆菌中异源表达并纯化了带有His标签的BcGH61蛋白，并将其注射到烟草叶片中。结果显示，30 μM的BcGH61蛋白在48小时内即可诱导叶片组织快速萎蔫，且该效应具有浓度依赖性。这些结果共同证实了BcGH61具有诱导植物细胞死亡的能力。
BcGH61诱导细胞死亡的结构基础
为了探究BcGH61诱导细胞死亡的结构基础，研究者进行了结构同源建模和保守性分析，鉴定出其保守的催化口袋和两个形成分子内二硫键的保守半胱氨酸残基（C73和C195）。通过定点突变，研究者构建了催化活性缺失突变体（如BcGH61H19A、BcGH61H181A Q190A Y192A等）和二硫键破坏突变体（BcGH61C73A C195A）。瞬时表达实验表明，这些突变体诱导细胞死亡的能力均显著减弱，其中四重突变体（BcGH61H19A H181A Q190A Y192A）完全丧失了毒性。蛋白质印迹分析排除了表达水平差异的影响。此外，通过构建一系列截短突变体，研究者发现BcGH61的193-240位氨基酸片段是其诱导细胞死亡所必需的关键区域。这些结果表明，BcGH61的完整细胞死亡诱导能力依赖于其催化活性、保守的二硫键以及特定的结构域。
BcGH61激活植物免疫反应
研究者进一步探究了BcGH61是否能够激活植物免疫反应。在烟草叶片中瞬时表达BcGH61后，用灰葡萄孢菌菌丝块进行攻毒实验，结果显示BcGH61表达区域对病原菌的侵染表现出更强的抗性。通过RT-qPCR分析，研究者发现BcGH61能够显著上调水杨酸（SA）信号通路相关基因（如NbEDS1、NbPR1、NbPR5）、过敏反应（HR）调节因子（NbHIN1）、PTI相关基因（NbPIT5）以及苯丙烷代谢途径关键酶基因（NbPAL）的表达。有趣的是，尽管催化活性缺失突变体（BcGH61EM）完全丧失了诱导细胞死亡的能力，但其激活植物免疫反应的能力与野生型蛋白相当，表明BcGH61的免疫激活活性与其催化活性是相互独立的。
BcGH61诱导的细胞死亡不依赖于BAK1/SOBIR1信号通路
为了探究BcGH61诱导细胞死亡的信号通路，研究者利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，在本氏烟中分别沉默了NbBAK1和NbSOBIR1基因。RT-qPCR证实了沉默效率。随后，在沉默植株的叶片中瞬时表达BcGH61，结果显示，在NbBAK1和NbSOBIR1沉默的植株中，BcGH61依然能够诱导强烈的细胞死亡，其表型与对照植株无显著差异。蛋白质印迹分析证实了BcGH61在各处理组中的表达水平一致。这些结果表明，BcGH61诱导的细胞死亡不依赖于经典的免疫共受体BAK1和SOBIR1，提示其可能通过其他未知的受体或共受体发挥作用。
BcGH61是灰葡萄孢菌的关键毒力因子
为了明确BcGH61在灰葡萄孢菌致病过程中的作用，研究者首先检测了bcgh61基因在侵染过程中的表达模式。RT-qPCR分析显示，在侵染菜豆叶片的早期阶段（0-24 hpi），bcgh61的表达量上调；在侵染中期（36-48 hpi）表达量短暂下调；而在60 hpi时，其表达量达到峰值，约为基线水平的16倍，表明bcgh61在病原菌侵染过程中发挥着重要作用。随后，研究者构建了bcgh61基因敲除突变体（Δbcgh61）和回补菌株（Com-bcgh61）。致病性分析表明，与野生型菌株相比，Δbcgh61突变体在菜豆叶片上形成的病斑显著减小，而回补菌株的毒力则恢复到野生型水平。此外，Δbcgh61突变体在PDA培养基上的菌落形态、生长速率以及对细胞壁胁迫（如刚果红、SDS、NaCl）的敏感性均未发生改变。这些结果表明，BcGH61是灰葡萄孢菌的关键毒力因子，但其对病原菌的营养生长和细胞壁完整性并非必需。
BcGH61与本氏烟NbHrBP1蛋白互作
为了深入解析BcGH61激活免疫反应的分子机制，研究者通过免疫共沉淀偶联质谱分析（IP-MS）筛选与BcGH61互作的植物蛋白，发现BcGH61与本氏烟过敏反应结合蛋白1（NbHrBP1）存在特异性互作。通过酵母双杂交（Y2H）和植物体内的免疫共沉淀（Co-IP）实验，研究者进一步证实了BcGH61与NbHrBP1之间的直接相互作用。值得注意的是，BcGH61中负责诱导细胞死亡的关键区域（193-240位氨基酸）并不参与与NbHrBP1的互作，提示BcGH61的细胞死亡诱导功能和免疫激活功能可能由不同的结构域介导。
NbHrBP1介导细胞内免疫感知但不参与细胞死亡诱导
为了探究NbHrBP1在BcGH61诱导的细胞死亡和免疫反应中的作用，研究者利用VIGS技术沉默了本氏烟中的NbHrBP1基因。在NbHrBP1沉默的植株中瞬时表达BcGH61，结果显示BcGH61依然能够诱导强烈的细胞死亡，表明NbHrBP1不参与BcGH61诱导的细胞死亡过程。然而，在NbHrBP1沉默的植株中，定位于细胞质的BcGH61（BcGH61ΔSP）激活防御相关基因表达的能力显著减弱，而分泌到质外体的全长BcGH61激活免疫反应的能力则不受影响。这些结果表明，NbHrBP1是BcGH61在细胞内被感知的关键受体，介导了BcGH61的细胞内免疫感知，但不参与其诱导的细胞死亡。
NbHrBP1参与宿主对灰葡萄孢菌的防御反应
研究者进一步探究了NbHrBP1在植物防御反应中的作用。RT-qPCR分析显示，在灰葡萄孢菌侵染本氏烟叶片的早期阶段（0-24 hpi），NbHrBP1的转录水平上调；而在侵染后期（36-72 hpi），其表达量急剧下降。在烟草叶片中过表达NbHrBP1后，进行灰葡萄孢菌攻毒实验，结果显示过表达植株的发病程度显著减轻，病斑面积明显小于对照植株。通过RNA-seq分析，研究者发现NbHrBP1过表达能够诱导植物-病原互作、MAPK信号通路等相关基因的显著上调。这些结果表明，NbHrBP1是植物防御反应的正调控因子，能够通过重编程转录组来激活关键防御通路，从而增强对灰葡萄孢菌的抗性。
讨论与总结
本研究揭示了灰葡萄孢菌分泌的效应蛋白BcGH61在植物-病原互作中的双重作用。在细胞外，BcGH61通过其糖苷水解酶活性降解植物细胞壁，释放损伤相关分子模式（DAMPs），从而诱导细胞死亡并激活免疫反应；同时，其诱导细胞死亡的过程不依赖于经典的BAK1/SOBIR1信号通路，提示可能存在新的受体或共受体参与其中。在细胞内，BcGH61通过未知的机制进入植物细胞，并与定位于叶绿体类囊体膜和质体小球（plastoglobule）的NbHrBP1蛋白直接互作，从而激活细胞内免疫感知，诱导防御相关基因的表达。这种空间分离的功能模式揭示了BcGH61作为一种关键毒力因子，通过操纵宿主的防御执行和细胞死亡途径，为病原菌的成功侵染创造了有利的微环境。该研究为理解坏死性病原菌的致病机制及植物免疫识别策略提供了新的分子框架。
