《Scientifica》：The Constituents of Phyllanthus emblica Fruit Ameliorate Hyperlipidemia Through the Modulation of SREBPs, HMG-CoA Reductase, and LDL Receptor Pathway
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本文通过整合计算机模拟（in silico）、体外（in vitro）和体内（in vivo）研究方法，深入探讨了富含抗氧化剂的余甘子（Phyllanthus emblica）果实粉末（PEF）改善高脂饮食（HFD）诱导的高脂血症的分子机制。研究发现PEF中的活性成分（如槲皮素、山奈酚、儿茶素、白杨素等）可通过调节固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1c, SREBP-2）、HMG-CoA还原酶（HMGCR）和低密度脂蛋白受体（LDLR）等关键靶点的表达，有效降低有害血脂水平，其作用与改善氧化应激密切相关。本研究为开发以植物为基础的抗高脂血症疗法提供了新的见解和实验依据。
1. 引言
高脂血症是代谢综合征的关键组成部分，其特征是血浆总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）水平升高，以及高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）水平降低。当前治疗高脂血症的合成药物（如他汀类、贝特类等）存在不良反应，因此从药用植物中寻找更安全的替代品备受关注。余甘子（Phyllanthus emblica L.，又称印度醋栗）果实因其高抗氧化成分含量而显示出显著的治疗潜力。除初级代谢产物外，该果实含有丰富的生物活性次级代谢产物，包括维生素、单宁、酚类和非酚类化合物。临床前和临床研究表明，余甘子中的多种酚类化合物（如槲皮素、山奈酚、没食子酸、鞣花酸、儿茶素等）通过其抗氧化和抗炎特性，能够减轻高脂血症和高血糖。然而，余甘子及其生物活性植物化学物质调节脂质代谢和稳态的分子机制仍不清楚。本研究通过整合计算机模拟（in silico）、体外（in vitro）和体内（in vivo）方法，旨在研究余甘子植物化学物质通过与饮食诱导的高脂血症相关的几种蛋白质相互作用，对高脂血症的影响。
2. 材料与方法
2.1. 化学品与试剂
研究所用标准品（如没食子酸、鞣花酸、儿茶素、槲皮素等）及试剂均购自Sigma-Aldrich、Merck等公司。
2.2. 植物化学物的筛选与计算机模拟药代动力学评价
通过文献调研，筛选出余甘子果实中的21种具有抗氧化、抗炎、降血脂和降血糖特性的植物化学物。使用SwissADME在线工具预测这些化合物的药代动力学特性和类药性（基于Lipinski五规则）。使用Egan BOILED-Egg模型预测胃肠道吸收和血脑屏障（BBB）穿透性。阿托伐他汀作为对照标准品。
2.3. 选定植物化学物的分子对接分析
对具有良好药代动力学特性和类药性的16种化合物，与8个在脂质代谢和稳态中起关键作用的蛋白质进行分子对接分析。这些蛋白质包括：固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）、SREBP-2、视黄醇X受体α（RXRα）、肝X受体α（LXRα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、HMG-CoA还原酶（HMGCR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和脂肪酸结合蛋白4（FABP4）。使用AutoDockTools 1.5.7和CB-Dock2服务器进行盲对接计算结合能（kcal/mol），并使用BIOVIA Discovery Studio可视化相互作用。
2.4. 标准饮食、高脂饮食（HFD）和余甘子果实粉末（PEF）补充饮食的制备
余甘子果实经鉴定、切块、风干（40°C）后研磨成细粉。以美国营养研究所的AIN-76A饮食成分为框架，制备正常饮食（对照组）、2%（w/w）PEF补充的正常饮食（对照组+PEF）、高脂饮食（HFD）以及2%（w/w）PEF补充的高脂饮食（HFD+PEF）。HFD的热量密度（5192 kcal/kg）显著高于正常饮食（3782 kcal/kg），其中脂肪供能比分别为52.4%和11.9%。
2.5. 总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、自由基清除活性和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）测定
制备余甘子果实乙醇提取物，用于测定TPC（Folin-Ciocalteu法）、TFC（氯化铝比色法）、DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性和FRAP。抗坏血酸和丁基羟基甲苯（BHT）作为标准对照。
2.6. HPLC分析
采用反相HPLC（C18柱）分析PEF乙醇提取物中的多酚类化合物。通过对比标准品的保留时间，定性并定量检测了多种活性成分。
2.7. 研究设计与动物饲养
雄性Wistar大鼠（8-9周龄，190 ± 8 g）随机分为4组（n=7）：对照组（标准饮食）、对照组+PEF（标准饮食+2% PEF）、HFD组（高脂饮食）、HFD+PEF组（高脂饮食+2% PEF）。实验持续8周，期间监测体重变化、食物和水的摄入量。
2.8. 血糖测量、血清、肝脏和脂肪组织收集
实验结束时，测量空腹血糖（FBS）。通过注射氯胺酮处死大鼠，收集血液（分离血清）、肝脏（部分用于RNA提取，部分用于组织学）和不同部位的脂肪组织（腹膜后、附睾、肠系膜），称重并记录。
2.9. 氧化应激和血浆脂质评估
测定血清中丙二醛（MDA，硫代巴比妥酸法）、一氧化氮（NO，Griess试剂法）、高级氧化蛋白产物（AOPP，340 nm吸光度）、还原型谷胱甘肽（GSH，Ellman's试剂法）的水平，以及超氧化物歧化酶（SOD，Kakkar法修改）和过氧化氢酶（CAT，商业试剂盒）的活性。使用Plasmatec Laboratories的诊断试剂盒测定血浆TC、TG、LDLC和HDLC浓度。
2.10. 基因表达定量
从肝组织中提取总RNA，反转录成cDNA。使用特异性引物（见表1）和SYBR Green Master Mix进行实时定量PCR（qPCR），检测SREBP-1c、SREBP-2、RXRα、LXRα、PPARγ、HMGCR、LDLR、FABP4等基因的mRNA水平，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因进行标准化。
2.11. 组织学分析
肝组织经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片（5 μm）后，进行苏木精-伊红（H&E）染色。在光学显微镜（40倍）下观察并拍照，使用ImageJ软件分析脂滴覆盖面积百分比。
2.12. 统计分析
体外实验设3个重复（n=3），体内实验设6个重复（n=6）。数据以均值±标准误（SEM）表示。采用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行适当的事后检验（如Newman-Keuls检验）比较组间差异，p < 0.05认为有统计学意义。
3. 结果
3.1. 选定化合物的药代动力学和药用特性评估
SwissADME分析显示，21种化合物中有16种（包括没食子酸、鞣花酸、槲皮素、甜菜碱、山奈酚、儿茶素、白杨素等）具有口服生物利用度。Egan BOILED-Egg模型预测表明，这些化合物具有良好的胃肠道吸收特性，其中白杨素和香豆酸可能穿透血脑屏障。而杨梅苷、帕罗霉素、芦丁、鞣花单宁和pedunculagin这5种化合物由于拓扑极性表面积（TPSA）过高（>150）、违反Lipinski规则次数多（≥2）且生物利用度评分（BS）低，未被纳入后续对接研究。
3.2. 选定分子与靶蛋白的相互作用
分子对接结果显示，余甘子中的多种化合物与8个靶蛋白具有较强的结合亲和力（结合能 < -8.0 kcal/mol被认为是强结合）。特别是槲皮素、山奈酚、儿茶素和白杨素与SREBP-2结合紧密。白杨素也与RXRα和LXRα强效结合。鞣花酸和槲皮素与FABP4显示强相互作用。对接评分详见表3，相互作用的2D和3D模型见图2和图3。
3.3. TPC、TFC及抗氧化活性测定
PEF乙醇提取物的总酚含量（TPC）为213.3 ± 8.2 mg GAE/g，总黄酮含量（TFC）为57.4 ± 5.7 mg QE/g，表明PEF是酚类和黄酮类化合物的丰富来源。在抗氧化活性方面，PEF的DPPH自由基清除活性（IC50= 2.81 ± 0.26 μg/mL）略优于BHT，但显著低于抗坏血酸。PEF的ABTS自由基清除活性和FRAP值均显著高于BHT（p < 0.05）。具体数据见表4。
3.4. 多酚类植物化学物的HPLC检测
HPLC分析确认了PEF中存在7种主要生物活性化合物：一种酚酸（没食子酸）、一种氨基酸（亮氨酸）、一种多酚（鞣花酸）和四种黄酮类化合物（儿茶素、白杨素、山奈酚、槲皮素）。其中，没食子酸、儿茶素、鞣花酸和槲皮素的含量相对较高。色谱图见图4，各化合物含量见表5。
3.5. PEF对食物消耗、体重和脂肪重量的影响
与对照组相比，HFD喂养显著增加了大鼠的最终体重、肝脏重量以及附睾、肠系膜和腹膜脂肪重量（p < 0.05）。补充2% PEF的HFD（HFD+PEF）显著降低了HFD引起的肠系膜脂肪重量增加（p < 0.05），但对HFD引起的总体重、肝脏重量、附睾脂肪和腹膜脂肪重量的增加没有产生显著影响。补充PEF的正常饮食（对照组+PEF）与正常饮食对照组相比，各项参数均无显著差异。结果详见表6。
3.6. PEF对HFD诱导的氧化应激的影响
HFD喂养导致血浆MDA、NO和AOPP水平显著升高，同时内源性抗氧化剂GSH水平以及SOD和过氧化氢酶活性显著降低（p < 0.05）。喂养补充2% PEF的HFD后，SOD和过氧化氢酶活性显著增强（p < 0.05），从而显著降低了MDA、NO和AOPP水平。同时，HFD消耗导致的GSH耗竭也因PEF喂养而得到显著恢复（p < 0.05）。补充PEF的正常饮食对这些氧化应激参数没有影响。结果表明PEF补充主要通过其抗氧化特性缓解HFD诱导的氧化应激。数据图示见图5。
3.7. 余甘子果实的降血脂和降血糖作用
HFD喂养导致血浆TG、TC、LDLC和FBS水平显著升高，HDLC水平显著降低（p < 0.05）。喂养补充2% PEF的HFD后，TC、LDLC、TG和FBS水平均显著降低（p < 0.05），同时被HFD抑制的HDLC水平得到恢复。补充PEF的正常饮食对这些血脂和血糖参数没有显著影响。具体数据见表7。
3.8. 余甘子对靶基因表达的影响
qPCR结果显示，HFD喂养显著上调了SREBP-1c、SREBP-2、LXRα、PPARγ、HMGCR和FABP4的mRNA表达水平（p < 0.05），但未改变RXRα的表达，并下调了LDLR的表达。喂养补充2% PEF的HFD后，与HFD组相比，SREBP-1c、SREBP-2和HMGCR的转录水平被显著下调（p < 0.05），同时被HFD抑制的LDLR表达得以恢复。然而，PEF补充对HFD引起的PPARγ、LXRα和FABP4的mRNA水平升高没有产生显著改变。在对照组和对照组+PEF组之间，这些蛋白的表达水平相似。结果图示见图6。
3.9. 余甘子对肝脏脂肪积累的影响
肝组织H&E染色显示，HFD喂养导致肝细胞内脂滴（LDs）的数量和大小显著增加（p < 0.05）。喂养补充PEF的HFD并未显著改变HFD引起的肝脏脂质积累（脂滴面积百分比无显著差异）。组织学观察与ImageJ定量分析结果一致（图7a-7e），这也与肝脏重量在HFD+PEF组未显著减轻的结果相符（表6）。
4. 讨论
本研究表明，富含多酚和黄酮类化合物的余甘子果实粉末（PEF）能够有效改善HFD诱导的Wistar大鼠高脂血症，其作用机制与调节脂质代谢关键蛋白的表达密切相关。
计算机模拟研究预测并验证了PEF中多种生物活性成分（如槲皮素、山奈酚、儿茶素、白杨素、鞣花酸等）具有良好的口服生物利用度和类药性，并能与SREBP-2、LXRα、RXRα、FABP4等靶蛋白强效结合。体内实验证实，PEF补充能显著改善HFD引起的氧化应激状态，提高抗氧化酶（SOD、CAT）活性和GSH水平，降低氧化损伤标志物（MDA、NO、AOPP）。
在分子水平上，PEF发挥降血脂作用的核心机制在于下调SREBP-1c和SREBP-2这两个主调控转录因子的表达。SREBPs的下游靶基因HMGCR（胆固醇合成的限速酶）的表达也随之被抑制，这有助于减少内源性胆固醇的合成。同时，PEF补充上调了LDLR的表达，促进了肝脏对循环中LDLC的摄取和清除。这几方面的协同作用最终导致血浆中有害脂质（TC、LDLC、TG）水平的降低。
值得注意的是，PEF补充虽然降低了血浆脂质水平，但并未显著减少HFD引起的总体重增加、肝脏重量增加以及大部分脂肪组织的沉积（除肠系膜脂肪外）。这与PEF未能显著改变HFD上调的PPARγ和LXRα表达有关。PPARγ和LXRα是促进脂肪生成和脂质储存的关键转录因子。PEF中的某些成分（如槲皮素）甚至被报道可上调LXRα和PPARγ，这可能有助于促进胆固醇逆向转运和提高HDLC水平，但同时也可能利于脂质在脂肪组织中的储存。因此，PEF的作用更倾向于将脂质从血液循环“转移”至储存部位，从而改善高脂血症，而非直接促进脂肪分解或减少脂肪总量。
此外，PEF丰富的抗氧化成分通过减轻氧化应激，可能间接影响了SREBPs等对氧化还原状态敏感的转录因子的活性，构成了其降血脂效应的另一层机制。
综上所述，余甘子果实粉末主要通过其多酚和黄酮类成分，调控SREBP/HMGCR/LDLR通路，抑制胆固醇合成，促进LDLC清除，并可能通过抗氧化作用间接调节脂质代谢，从而有效缓解HFD诱导的高脂血症。其活性成分如槲皮素、山奈酚、儿茶素、白杨素、鞣花酸等，是具有开发潜力的降血脂先导化合物。
5. 结论
本研究证实，余甘子果实粉末（PEF）富含多种具有良好生物利用度的酚类和黄酮类化合物，具备显著的体外和体内抗氧化活性。其降血脂作用的主要分子机制在于：下调SREBP-1c和SREBP-2的转录表达，进而抑制其下游靶点HMGCR的表达，减少胆固醇合成；同时上调LDLR的表达，促进循环中LDLC的清除。然而，PEF（2%剂量，8周干预）对促进脂质储存的转录因子PPARγ和LXRα的表达影响不显著，这可能是其未能有效减少HFD诱导的总体脂积累和体重增加的原因。PEF中的活性成分（如槲皮素、山奈酚、儿茶素、白杨素、鞣花酸等）是开发特异性强、不良反应少的降血脂药物的潜在先导化合物。未来研究可探索更高剂量或更长疗程的PEF干预是否能在改善血脂的同时减少体脂蓄积。
