解读生物防治效果以及基于计算机模拟的机制阐明：Trichoderma asperellum和Bacillus licheniformis对由Sclerotium rolfsii引起的花生茎腐病的防治作用

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Deciphering Biocontrol Efficacy and In Silico Mechanistic Elucidation of Trichoderma asperellum and Bacillus licheniformis against Groundnut Stem Rot Caused by Sclerotium rolfsii

花生茎腐病是由土传真菌Sclerotium rolfsii引起的毁灭性病害，本研究筛选出Trichoderma asperellum AUT5和Bacillus licheniformis AUB7两种拮抗菌株，通过体外 poisoned food assay发现其代谢产物BDDF和CC3对S. rolfsii有显著抑制效果（85.55%和80.22%），并利用GC-MS鉴定关键代谢物，结合分子对接和动态模拟验证其与真菌效应蛋白的高效结合，温室试验证实其能降低病害发生率26.20%。

　　

作者名单：Sivaji Jeevanantham、Renganathan Periyasamy、Suthin Raj Thankaraj、Meena V. Ruppavalli、Annadurai Praveen、Rajendiran Livitha、Rajkumar Sudharsan、Muthusamy Karthikeyan

印度泰米尔纳德邦Chidambaram市Annamalai大学农业学院植物病理学系 - 608002

摘要

Sclerotium rolfsii是一种破坏性的土壤传播病原体，会导致花生（Arachis hypogaea）发生茎腐病，造成高达80%的产量损失。尽管人们广泛研究对抗性微生物以用于生物防治，但其作用机制仍不完全清楚。本研究调查了从花生根际分离出的Trichoderma asperellum AUT5和Bacillus licheniformis AUB7的拮抗效果及其分子基础。通过tef1-α、β-tubulin、rpb2、cal和gyrB基因标记确认了这些菌株的身份。体外实验表明，AUT5（85.55%）和AUB7（80.22%）显著抑制了S. rolfsii的生长。对T. asperellum AUT5和B. licheniformis AUB7的粗提物进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析，鉴定出具有丰富生物活性的潜在抗真菌代谢物。分子对接分析显示，3,6-双二甲氨基甲基-2,7-二羟基芴-9-酮（BDDF）和查尔酮3（CC3）是效果最强的代谢物，它们与S. rolfsii效应因子的结合能力比商业杀菌剂更强。通过CABS-flex和iMODS进行的分子动力学模拟进一步验证了这些配体-蛋白复合物的稳定性和有效性。使用纯形式的BDDF和CC3进行的毒化食物实验表明，在高浓度下它们具有强烈的抑制作用。温室试验表明，含有T. asperellum AUT5和B. licheniformis AUB7的配方显著降低了茎腐病的发生率（26.20%），同时增强了处理后植物的防御酶活性。本研究强调了本地拮抗微生物及其代谢物作为化学杀菌剂替代品在可持续控制花生茎腐病方面的潜力。

引言

花生（Arachis hypogaea L.）是全球最重要的油料作物之一，在植物油生产中发挥着关键作用，并支撑着数百万农民的生计。然而，其生产力受到各种生物和非生物胁迫的严重影响，其中真菌病害是一个主要威胁[1]。由Sclerotium rolfsii引起的花生茎腐病会导致25%至70%的严重产量损失。这种土壤传播的多食性病原体具有广泛的宿主范围，可感染500多种植物，包括花生、辣椒、茶叶等[2]。S. rolfsii在温暖潮湿的气候中生长旺盛，并且由于能够形成称为菌核的持久休眠结构而难以控制。这些菌核最初为白色，成熟后变为棕色或黑色（0.1–3.0毫米），外形类似芥末籽，可以在土壤中存活很长时间[3]。在适宜条件下，它们会萌发形成菌丝体并引发感染，使得该病原体具有高度抗性且难以管理。传统的花生茎腐病管理措施，如轮作、种植抗性品种和施用化学杀菌剂，效果有限。虽然这些方法可以提供部分控制，但其有效性受到环境污染、对有益土壤微生物群的影响以及抗杀菌剂菌株出现的影响[4]。几种杀菌剂，包括环己酰亚胺、卡苏加霉素、戊唑醇和 Carbendazim，在限制这种侵袭性土壤传播病原体S. rolfsii的生长方面显示出良好的效果[5]。在这种情况下，生物防治作为一种有前景且环保的替代方案应运而生。

有益微生物如Trichoderma属和Bacillus属因其通过多种机制（包括抗菌作用、菌寄生、营养和空间竞争以及增强宿主防御途径）抑制植物病原体的能力而受到广泛认可。尽管已经筛选出多种对抗S. rolfsii的拮抗微生物，但针对Trichoderma asperellum和Bacillus licheniformis的研究相对较少。Akash等人的研究[6]表明，一种来自根际的T. asperellum分离株在实验室条件下显著抑制了S. rolfsii的生长。然而，由于缺乏代谢物分析和体内验证，其抗真菌机制尚未得到充分阐明。一些近期研究在综合病害管理方法中探索了T. asperellum的应用，例如将其与植物制剂结合使用，显示出减少茎腐病严重程度和改善花生植株表现的效果[7]。在Bacillus属方面也取得了进展，大部分研究集中在B. velezensis上，它通过挥发性有机化合物（VOCs）和激活宿主防御途径来抑制病害[8]。对B. licheniformis的兴趣也在增加，纳米制剂和载体基制剂显示出抗真菌活性、促进植物生长和减少辣椒植株病害的效果[9]。尽管有这些积极进展，但涉及T. asperellum和B. licheniformis对抗S. rolfsii的比较研究仍然很少，它们的精确生化和分子作用机制也尚未完全了解。

在生物防治系统中，Trichoderma和Bacillus因其产生多种具有抗真菌和植物有益功能的次级代谢物而受到重视[10]、[11]。这些代谢物包括肽类、聚酮类、萜类和非核糖体肽，它们干扰病原体的发育并触发植物的防御机制。据报道，Trichoderma属单独就能产生超过300种次级代谢物，其中45种以上具有强抗菌活性[12]。然而，使用单一微生物菌株可能会导致效果不稳定，而多种菌株的组合可以提高定殖效率、适应环境条件的能力以及整体抗真菌效果。另一方面，Bacillus属通过产生挥发性和非挥发性代谢物来抑制病原体，从而破坏病原体的代谢并增强植物的免疫信号传导[10]、[13]。这些次级代谢物由菌株特异的基因簇编码，可以抑制病原体的关键过程，包括毒素生物合成和能量代谢[14]。为了识别和表征这些化合物，使用了气相色谱和质谱等分析工具。此外，计算机模拟方法（如分子对接）在预测抗菌化合物与病原体目标蛋白之间的相互作用方面变得越来越有价值，有助于发现具有高结合亲和力和特异性的新型抗真菌分子[15]。

宿主-病原体相互作用通常涉及复杂的分子识别事件。S. rolfsii的致病性主要归因于其产生的碳水化合物活性酶（CAZymes），这些酶能够降解植物细胞壁的成分（如纤维素、半纤维素和果胶），从而实现组织入侵和定殖[16]。另一个关键的毒力因子是草酸，它有助于宿主组织的降解和免疫抑制。草酸的生物合成由草酸乙酰水解酶（OAH）催化，该酶有助于在感染期间维持高水平的草酸。这使得病原体能够削弱植物的防御机制，因此OAH成为疾病控制的关键靶点[17]。此外，像CYP51（羊毛甾醇14α-脱甲基酶）和琥珀酸脱氢酶（SDH）这样的真菌酶对真菌膜的合成和呼吸作用至关重要[18]、[19]。唑类和SDHI杀菌剂针对这些酶进行抑制，从而限制真菌的甾醇生物合成和能量产生，进而限制真菌的生长和存活能力。了解S. rolfsii中这些效应因子的结构和功能对于设计有效的控制策略至关重要，尤其是在面对日益严重的杀菌剂抗性时。

分子对接研究用于研究这些毒力蛋白与潜在抗真菌化合物之间的相互作用。虽然传统的对接方法可以提供初步见解，但它们往往无法考虑蛋白质的灵活性，而这对于准确的结合预测至关重要。为了克服这一问题，像CABS-flex 2.0这样的先进工具可以模拟蛋白质动态，从而更真实地模拟受体-配体相互作用[20]。为了进一步研究这些蛋白-配体复合物的稳定性和动态，采用了分子动力学（MD）模拟。MD可以在各种环境条件下提供分子在原子水平上的热力学性质和行为信息[21]、[22]。此外，含有Trichoderma和Bacillus的配方在温室条件下显著降低了病害发生率[23]。这些有益微生物可以通过上调关键抗氧化酶（如过氧化物酶（PO）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）的活性来增强植物的先天防御系统，这些酶在减轻病原体入侵和促进系统抗性方面起着关键作用[24]、[25]、[26]。

然而，大多数针对S. rolfsii的研究集中在已建立的生物防治菌株上，如T. harzianum和B. velezensis，而尽管有很强的拮抗潜力，T. asperellum和B. licheniformis》的研究仍然相对较少。鉴于它们的代谢多样性和互补的作用模式，这两种菌株是下一代S. rolfsii生物防治解决方案的有希望的候选者。为了评估这一潜力，本研究采用了一种综合方法，结合了代谢物分析、分子对接和模拟以及在实验室和温室条件下的功能验证，从而为开发更有效和环境可持续的花生茎腐病管理策略做出了贡献。

从茎腐病感染的花生植株中分子确认S. rolfsii

从印度泰米尔纳德邦各地茎腐病感染的花生植株中获得了10株S. rolfsii分离株。该病原体最初是根据形态特征鉴定的，并通过Koch假设在花生植株（品种TMV 2）中确认了其毒力。最具毒力的分离株S. rolfsii AUSr3进一步通过18S rRNA基因测序（登录号：OQ568182.1）进行了分子表征[29]。为了进一步确认AUSr3的身份，进行了翻译...

从茎腐病感染的花生植株中S. rolfsii

的分子表征

导致花生茎腐病的S. rolfsii AUSr3分离株的基因组DNA（图S1）经过PCR扩增，针对tef1-α、β-tubulin和rpb2区域进行扩增。PCR产物分别为536 bp、317 bp和938 bp（图S2）。tef1-α、β-tubulin和rpb2序列的BLASTN分析显示与Agroathelia rolfsii有98-100%的同一性。基于tef1-α、β-tubulin和rpb2基因序列构建的系统发育树强有力地确认了AUSr3的分离株属于A.

讨论

S. rolfsii仍然是花生生产中的持续威胁[43]，主要是因为其广泛的宿主范围和通过菌核在土壤中长时间存活的能力，这限制了基于杀菌剂的长期管理效果[44]。尽管常规使用如Carbendazim和Captan等化合物，但田间效果的变异性以及环境和监管方面的担忧促使人们寻找更安全、更持久的替代品[45]。

结论

本研究确定Trichoderma asperellum AUT5和Bacillus licheniformis AUB7是对抗S. rolfsii（导致花生茎腐病的病原体）的有效生物防治剂。综合代谢物分析结合计算相互作用分析表明，BDDF和CC3是关键的生物活性化合物，它们对多种毒力相关蛋白表现出强烈的亲和力，表明其具有多靶点抑制作用。重要的是，尽管这些代谢物表现出显著的抗真菌效果...

作者贡献声明

Renganathan Periyasamy：监督、方法学、研究。 Sivaji Jeevanantham：撰写——初稿、可视化、软件、方法学、概念化。 Meena V Ruppavalli：撰写——审稿与编辑、验证、资源、项目管理。 Thankaraj Suthin Raj：撰写——审稿与编辑、监督、概念化。 Rajendiran Livitha：可视化、研究、数据管理。 Annadurai Praveen：撰写——审稿与编辑、验证、方法学。 Karthikeyan：

<未引用的参考文献>

科学写作中生成式AI的声明

在准备本手稿期间，作者使用了ChatGPT (OpenAI)来提高语言清晰度和可读性。使用该工具后，作者彻底审查、修订并验证了内容的准确性，并对发表文章的完整性负全责。

资金

本手稿未获得任何资助机构的特定资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们衷心感谢Annamalai大学农业学院植物病理学系提供了进行这项研究所需的基本设施和支持。