《Plant Stress》：Molecular mechanisms involved in the biocontrol of post-harvest pathogen
Penicillium digitatum
编辑推荐：
这篇综述系统阐述了柑橘采后绿霉病（由指状青霉Pd引起）的防治挑战与前沿策略。文章重点探讨了Pd的致病分子机制（如转录因子、细胞壁降解酶、蛋白激酶、转运蛋白等关键因子），并综述了柑橘果实自身的免疫反应（如活性氧ROS、一氧化氮NO、初级与次级代谢物）。同时，文章展望了生物防治（如拮抗微生物）、基因沉默技术（HIGS/SIGS）及基因组编辑（如CRISPR/Cas9）等替代合成杀菌剂的可持续防控新途径，为开发安全高效的柑橘采后病害管理方案提供了重要理论依据。
引言
柑橘果实营养丰富，是全球范围内广受欢迎的重要农产品，尤其在热带和亚热带地区。然而，柑橘采后阶段易受多种病害侵袭，其中由指状青霉（Penicillium digitatum, Pd）引起的绿霉病是最具破坏性的采后病害，在全球范围内造成巨大的经济损失，在欠发达和发展中国家损失率可高达30%。长期以来，合成杀菌剂（如抑霉唑、噻苯达唑、苯菌灵）是控制绿霉病的主要方法，但其使用带来了环境风险、人类健康危害及病原菌抗药性增强等问题。因此，寻找安全、有效的替代策略至关重要，生物防治和基于分子生物学的新技术展现出巨大潜力。
果实采后真菌病害的识别及其生物防治
在众多生物防治微生物中，细菌群落通常表现出优于其他生物的效果。例如，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）混合使用对橙子绿霉病的抑制率可达87%。然而，生物防治的效果并非总是理想，如丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）对绿霉病的抑制率仅为28%，这可能与菌株定殖能力、环境条件或其作用模式有关。生物防治剂的筛选通常从土壤或植物组织中分离开始，随后进行化学和分子生物学表征，并评估其对环境、植物、人畜的安全性。利用果实表面或健康柑橘相关附生或内生微生物组的微生物组合来防治采后病害，是当前研究的热点。
真菌传播的机理及影响因素
Pd是一种坏死性真菌病原体，通过机械损伤或环境因素（如冷害、灼伤、风害、冰雹、昆虫）造成的伤口侵染柑橘果实。采后绿霉病的症状包括受害果实上出现白色菌丝，后期变为灰绿色菌丝，最终导致果实腐烂和失水。分生孢子萌发是Pd侵染的关键步骤，其受多种因素影响。果实伤口释放的化合物（如香芹酮、松油烯）以及橙汁中的糖分和有机酸能促进Pd分生孢子萌发。温度和水活度（aw）也影响萌发，最适温度为25°C，水活度范围在0.90至1.00之间。
Pd侵染过程中的霉菌毒素
尽管在Pd侵染的柑橘中检测到了色醌阿拉明A和C等热原性生物碱，但Pd不产生其他主要霉菌毒素，如扩展青霉（Penicillium expansum）产生的棒曲霉素。Pd基因组中也缺乏产生其他重要霉菌毒素（如赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等）的基因簇。研究表明，敲除参与色醌阿拉明生物合成的tqaA基因并不影响Pd的毒力，表明这些生物碱并非Pd致病所必需，但它们可能具有杀虫活性，有助于驱避分解柑橘的昆虫。
Pd鉴定的分子方法及致病过程
Pd是全基因组测序的第一个植物病原性青霉属物种。其基因组大小约26 Mb，比近缘的非致病性菌株产黄青霉（P. chrysogenum）小，暗示其生活方式更为专化。全球不同地区的Pd分离株基因组高度相似，表明单一的Pd谱系近期在全球范围内扩张。通过农杆菌介导的转化（ATMT）系统，研究人员已鉴定出19个与Pd对柑橘果实毒力相关的关键致病因子，主要编码调节蛋白、细胞壁修饰酶、信号激酶和膜转运蛋白。
指状青霉致病性的分子框架及关键因子
转录因子在真菌致病性中的作用
转录因子在真菌致病性中扮演关键角色。PacC/Rim101信号通路参与病原菌对pH的感知和调节，ΔPdpacC突变体毒力降低，并影响细胞壁降解酶（如果胶酶Pdpg2和果胶裂解酶Pdpnl1）的表达。Ca2+/钙调磷酸酶通路相关的转录因子Crz1（ΔPdCrz1突变体）毒力降低，细胞壁完整性受损，与几丁质合成酶（CHS2, CHS3）和葡聚糖合成酶（FKS1）基因下调有关。甾醇调节元件结合蛋白SREBPs（PdsreA和PdsreB）调节麦角固醇生物合成，其突变体毒力降低，并下调了与膜功能和耐药性相关的甾醇14α-去甲基酶基因PdCYP51B。MAPK信号通路下游的转录因子Ste12（ΔPdSte12突变体）也导致生长和毒力下降，并影响多个转运蛋白基因和甾醇去甲基酶基因的表达。
细胞壁降解酶与指状青霉致病性的关联
降解植物细胞壁的酶（CAZymes）在病原菌侵染中至关重要。Pd侵染柑橘时，大量细胞壁相关酶基因表达上调。两个多聚半乳糖醛酸酶基因Pdpg1和Pdpg2的突变体（ΔPdpg1, ΔPdpg2）在柑橘上的病害症状减轻，ΔPdpg2尤其影响绿霉形成和半乳糖醛酸产生。真菌细胞壁的完整性同样重要，几丁质合成酶基因PdChsVII的突变体（ΔPdChsVII）细胞壁完整性和致病性发生改变。蛋白O-甘露糖基转移酶基因Pdpmt2的突变体（ΔPdpmt2）致病性降低，细胞壁结构改变。
蛋白激酶在指状青霉致病性中的作用
蛋白激酶通过磷酸化调控蛋白质功能，在真菌致病中起核心作用。MAPK通路三个同源基因——Pdos2（Hog1同源）、PdSlt2、PdMpkB（Fus3/Kss1同源）的突变体（ΔPdos2, ΔPdSlt2, ΔPdMpkB）在柑橘果实上的毒力均下降，其中ΔPdMpkB几乎不能引起腐烂。ΔPdMpkB突变体中多个细胞壁降解酶基因表达下调。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SNF1（ΔPdSNF1突变体）参与碳源利用调控，其缺失也导致毒力下降，并可能正调控细胞壁降解酶。
转运蛋白在指状青霉致病机制中的作用
ABC转运蛋白和MFS转运蛋白通常与真菌耐药性相关。两个MFS转运蛋白基因PdMfs1和PdMfs2的突变体（ΔPdMfs1, ΔPdMfs2）对柑橘果实的毒力降低，它们可能参与分泌有毒化合物（如色醌阿拉明）。一个推测的蔗糖转运蛋白基因PdSUT1的突变体（ΔPdSUT1）毒力也下降，可能在侵染过程中协助病原菌从宿主果实中摄取糖分。
探索指状青霉致病性的新基因
葡萄糖神经酰胺（GlcCer）是真菌膜脂的重要组分，其合成酶基因PdGcs1的突变体（ΔPdGcs1）不能合成GlcCer，菌丝生长和毒力显著下降。腺苷酸环化酶基因Pdac1的突变体（ΔPdac1）胞内cAMP水平降低，毒力减弱。细胞色素P450单加氧酶CYP51家族成员PdCYP51B的过表达能增强Pd在柑橘果实上的侵袭性，表明其除介导杀菌剂耐药性外，也通过调节麦角固醇合成影响致病性。
果实对Pd污染的免疫力
目前对Pd致病性的了解远超对果实抗病性的认知。几乎所有柑橘栽培品种都对Pd敏感，但感病严重程度（病斑大小、感染率）存在品种差异。果实成熟度显著影响绿霉病发展，未成熟果实的病斑通常小于商业成熟或过熟果实。柑橘果实对Pd的抵抗涉及多种反应。
柑橘果实抗性与活性氧和一氧化氮
活性氧（ROS，如H2O2、O2•?）和一氧化氮（NO）是植物应对生物胁迫的关键信号分子。Pd初始侵染阶段，柑橘果实会发生H2O2迸发，外源H2O2处理能增强果实对Pd的抗性。抗氧化剂褪黑素处理降低H2O2水平的同时，也降低了抗病性，并伴随防御相关基因下调及细胞壁构建基因上调，表明ROS可能通过激活防御基因和强化细胞壁来增强抗性。外源NO处理也能提高柑橘果实对Pd的抗性，但其具体作用机制有待进一步阐明。
柑橘代谢物在抗性中的作用
植物次级代谢物在防御中起重要作用。Pd侵染后，柑橘果实中黄烷酮、多乙氧基黄酮、扫若仑等次级代谢物积累，与异戊二烯类、生物碱类等合成相关的基因也上调。苯丙烷类代谢物及其衍生物处理可增强柑橘对Pd的抗性。初级代谢（如三羧酸循环TCA、糖酵解/糖异生、氨基酸生物合成）相关基因在抗病反应中也高度激活，为防御反应提供碳骨架和底物。热处理提高柑橘果实糖分水平，从而增强其抗病性，表明能量代谢和初级代谢在果实抗病中同样重要。
结论与展望
柑橘采后病害，特别是由Pd引起的绿霉病，是柑橘产业面临的重大挑战。对Pd致病分子机制（关键基因、信号通路、毒力因子）以及柑橘果实免疫机制（ROS/NO、代谢物）的深入理解，为开发新型防控策略奠定了基础。利用拮抗微生物进行生物防治、应用基因沉默技术（HIGS/RISA）以及基因组编辑工具（如CRISPR/Cas9）等替代方法展现出广阔前景。未来研究应着重于阐明拮抗菌的作用机制、挖掘果实抗病资源、优化生物防治应用策略，并推动这些创新技术在可持续柑橘采后病害管理中的实际应用。
