《In Silico Research in Biomedicine》：Targeting G and F proteins of human metapneumovirus: An
in silico strategy for multiepitope vaccine design
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本研究针对尚无获批疫苗的人偏肺病毒（hMPV）感染，利用免疫信息学方法，以病毒保守的糖蛋白（G）和融合蛋白（F）为靶点，设计了一种新型多表位亚单位疫苗。研究人员通过反向疫苗学策略筛选出79个免疫原性表位，构建了包含霍乱毒素B亚单位（CTB）佐剂的疫苗分子。该候选疫苗理化性质优良、结构稳定、非致敏，分子对接显示其与天然免疫受体TLR3/TLR4结合良好，免疫模拟预测可诱发强烈的体液与细胞免疫应答。该研究为开发安全有效的hMPV疫苗提供了有前景的候选分子。
冬季和春季是呼吸道感染的高发季节，除了人们熟知的流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和鼻病毒，一种名为人偏肺病毒（Human Metapneumovirus, hMPV）的病原体也逐渐引起关注。尤其是在中国北方的监测数据中，hMPV与季节性流感等共同导致了医院就诊率的上升。对于婴幼儿、老年人和免疫功能低下者，hMPV感染可能引发支气管炎、肺炎等严重疾病，甚至需要住院治疗。然而，与流感和RSV相比，hMPV的公众认知度和临床检测率较低，且目前全球范围内尚无针对该病毒的获批疫苗或特效抗病毒药物，这使得医疗卫生系统在面对疫情暴发时显得尤为脆弱。COVID-19大流行已经警示我们，对呼吸道病毒的忽视可能带来严重后果。因此，开发创新、有效且可快速应对新发病毒威胁的疫苗策略迫在眉睫。
在此背景下，一篇发表在《In Silico Research in Biomedicine》上的研究论文《Targeting G and F proteins of human metapneumovirus: An in silico strategy for multiepitope vaccine design》为我们带来了希望。该研究独辟蹊径，完全在计算机（in silico）环境中，运用先进的免疫信息学（Immunoinformatics）和反向疫苗学（Reverse Vaccinology）策略，设计了一款靶向hMPV关键表面蛋白——糖蛋白（G）和融合蛋白（F）的多表位亚单位疫苗，为最终攻克hMPV疫苗难题迈出了关键一步。
为了完成这项设计，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：首先，他们从NCBI数据库获取hMPV的G和F蛋白序列，利用免疫表位数据库（IEDB）的算法预测能结合主要组织相容性复合体（MHC）-I类和II类分子的T细胞表位，并使用ABCpred服务器预测B细胞表位。其次，他们通过一系列生物信息学工具（如ProtParam, AllerTOP, VaxiJen）评估了候选表位和最终疫苗构建体的免疫原性、抗原性、过敏性及理化性质。接着，他们利用I-TASSER和GalaxyRefine等服务器预测并优化了疫苗的三维结构，并通过分子对接（ClusPro 2.0）和分子动力学模拟（GROMACS, iMODS）分析了疫苗与关键免疫受体（TLR3, TLR4）的相互作用和复合物稳定性。最后，他们使用C-ImmSim服务器进行了免疫反应模拟，并通过JCAT工具对疫苗序列进行密码子优化，以备在Escherichia coli中表达。值得注意的是，本研究是基于公开的病毒蛋白序列进行的计算机模拟，未涉及患者样本队列。
结果
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和辅助T淋巴细胞（HTL）表位预测
研究人员利用IEDB服务器从hMPV的G和F蛋白中筛选高免疫原性的表位。最终，从G蛋白中鉴定出31个MHC-I表位和10个MHC-II表位，从F蛋白中鉴定出48个MHC-I表位和36个MHC-II表位。所有这些HTL表位均被预测为具有干扰素-γ（IFN-γ）诱导能力。表位筛选严格基于其免疫原性和百分位排名（Percentile Rank），确保其具有高抗原潜力。
人群覆盖率分析
为确保疫苗能惠及全球广泛人群，研究团队评估了所选CTL和HTL表位对应HLA（人类白细胞抗原）等位基因的全球分布。分析结果显示，该疫苗构建体所覆盖的MHC-I和MHC-II表位组合，预计能为全球94.7%的人口提供保护，展现了其卓越的广泛适用性。
B细胞表位（BCEs）的鉴定与预测
有效的疫苗还需能激发强大的体液免疫。研究使用ABCpred服务器（阈值>0.8）进行B细胞表位预测，最终从G蛋白中确定了23个B细胞表位，从F蛋白中确定了56个B细胞表位。这些表位是诱导产生中和抗体的关键靶点。
疫苗构建体的制备与理化性质分析
疫苗的“蓝图”由此绘制。研究人员将筛选出的最优MHC-I、MHC-II和B细胞表位，分别通过AAY、GPGPG和KK linker（连接肽）串联起来。为了增强免疫反应，在N端还融合了霍乱毒素B亚单位（CTB）作为佐剂。最终构建的疫苗分子由528个氨基酸组成，分子量约为57.5 kDa。理化性质分析显示，该疫苗构建体稳定性良好（不稳定性指数为36.8），具有亲水性（GRAVY评分为-0.63），预测溶解度较高，且被证实为非过敏原。其理论等电点（pI）为10.55，呈碱性。
二级和三级结构预测
蛋白质的功能依赖于其精确的三维结构。二级结构预测表明，该疫苗分子主要由无规则卷曲（约占50%）和α螺旋构成。利用I-TASSER服务器预测了三级结构，并经过GalaxyRefine服务器优化。优化后的模型经ProSA验证（Z-score为-2.5）和Ramachandran图评估（95.7%的残基位于允许区），证实其结构质量高、构象合理。
过敏原性和抗原性预测
安全性是疫苗的首要考量。使用AllerTOP v.2.0工具预测表明，该多表位疫苗构建体不会引起过敏反应。同时，VaxiJen v.2.0分析给予其0.552的抗原性评分，高于0.4的阈值，确认了其具有良好的抗原性。
疫苗构建体与受体的分子对接
疫苗要发挥作用，需要被免疫系统的“哨兵”——如Toll样受体（TLR）识别。分子对接结果显示，疫苗构建体与TLR3和TLR4均能稳定结合，结合能分数分别为-1089.7和-1075.3。LigPlot分析进一步揭示了疫苗与受体之间的关键相互作用残基，为理解其激活免疫的分子机制提供了线索。
结构动力学与分子柔性分析
为了更真实地模拟疫苗-受体复合物在体内的动态行为，研究人员进行了分子动力学（MD）模拟和MM/PBSA（分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积）结合自由能计算。分析表明，疫苗与TLR3/TLR4形成的复合物在100纳秒的模拟时间内结构稳定，RMSD（均方根偏差）和Rg（回转半径）等参数均收敛。结合自由能分解提示，静电相互作用是驱动结合的主要力量。氢键分析也显示在结合界面存在持久稳定的氢键网络。
模拟免疫反应表明通过抗体和细胞因子产生高效应答
利用C-ImmSim服务器进行的免疫模拟实验给出了令人鼓舞的结果。模拟显示，接种该疫苗后，机体能产生强烈的免疫应答：抗原暴露后，IgM抗体迅速升高，随后发生抗体类别转换，IgG（特别是IgG2）滴度显著上升。同时，记忆B细胞和记忆T细胞数量随着接种次数增加而持续累积，表明形成了长效免疫记忆。此外，关键的免疫细胞因子如白细胞介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）的水平也大幅提升，这两者对于激活T细胞和抗病毒防御至关重要。
计算机（in silico）疫苗克隆
为了将设计蓝图转化为现实，研究团队使用JCAT服务器对疫苗的氨基酸序列进行了密码子优化，使其适合在常用表达系统——大肠杆菌（E. coli）中高效表达。优化后的序列密码子适应指数（CAI）高达0.95，GC含量为68.9%，这些都是高水平蛋白表达的有利指标。随后，该序列被成功“克隆”到pcDNA?3.1/V5-His-TOPO?表达载体中，为后续的体外表达实验奠定了基础。
讨论与结论
综上所述，这项研究成功地运用计算机辅助策略，设计出一款针对hMPV的多表位亚单位疫苗候选分子。该疫苗靶向病毒保守的G和F蛋白，涵盖了能激发细胞免疫（CTL, HTL）和体液免疫（BCE）的多种表位，具有全球人群覆盖率广、结构稳定、非过敏、抗原性强等特点。分子对接和动力学模拟证实其能与关键天然免疫受体TLR3/TLR4稳定结合，免疫模拟预测其能诱导强大的、持久的综合性免疫应答。
这项研究的重大意义在于，它展示了一条快速、经济、高效的疫苗前期开发路径。传统的疫苗研发耗时漫长且成本高昂，而免疫信息学方法能够在实验室研究开始之前，就对候选疫苗进行大量的“预筛选”和优化，大大降低了后期失败的风险，尤其适用于应对新发、突发传染病威胁。本研究为hMPV疫苗的研发提供了一个经过全面计算机验证的、有巨大潜力的候选分子，并建立了一套可复制的疫苗设计流程。当然，这项成果最终走向应用，还需要后续的体外细胞实验、动物模型验证以及临床试验来评估其真实世界的安全性和有效性。但无疑，这项工作为最终攻克hMPV感染，以及为其他呼吸道病毒疫苗的研发提供了宝贵的策略借鉴和坚实的基础。
