通过丙烯酸树脂固定化的脂肪酶进行酶促酯化反应以生产航空燃料的孔扩散机制：验证Langmuir-Hinshelwood模型的必要充分条件

《Surfaces and Interfaces》：Pore Diffusional Mechanism of the enzymatic esterification through acrylic resin immobilized lipase for producing an aviation fuel: Substantiating the necessary and sufficient conditions of the Langmuir-Hinshelwood model

该研究提出并验证了酶促竞争吸附模型，通过BET、DFT-HK、FTIR、XRD和pH_PZC分析证实丙烯树脂固定化脂酶的多孔结构特性，揭示了丁醇和丁酸在非特异性及酶活性位点吸附的差异，并建立Langmuir-Hinshelwood动力学模型解释吸附-催化协同机制，同时评估了环境因子E-factor、GWP和CED，为高效可持续的酶催化系统设计提供理论依据。

　　

德布利娜·森古普塔（Deblina Sengupta）|沙莫伊塔·达塔（Shamoyita Datta）|乌贾伊尼·萨克尔（Ujjaini Sarkar）

印度加尔各答贾达普尔大学（Jadavpur University）化学工程系，贾达普尔，邮编32。

摘要

本文提出了一种新的酶促竞争吸附模型，该模型考虑了酶的特异性相互作用，并将其与兰缪尔竞争吸附模型（Langmuir competitive adsorption model）进行了比较，用于研究丁酸（butyric acid, BA）和丁醇（butanol, BuOH）在丙烯酸树脂中固定的脂肪酶（lipase）上的吸附行为。这些反应适用兰缪尔-欣谢尔伍德（Langmuir-Hinshelwood, LH）动力学模型。通过BET、DFT–HK、FTIR、XRD和pH_PZC分析证实了这种多孔结构的存在，这种结构能够实现脂肪酶的稳定固定并促进反应物的高效传质。在单组分吸附过程中，丁醇的兰缪尔亲和常数（k_BuOH = 0.896 M?1）高于丁酸（k_BA = 0.4407 M?1），因此丁醇的吸附速率更快，且更倾向于覆盖酶表面。在竞争吸附过程中，由于丁醇的最大吸附容量（q_mBuOH = 130.0890 mmol/mg）较大，它主要吸附在非特异性位点上；而丁酸则更倾向于吸附在酶的活性位点上。LH参数的验证表明，较高的底物浓度可以降低能量消耗并提高产率，而产物形成受限会增加E因子。这些发现结合吸附行为、酶位点选择性和多孔结构的特点，为设计高效且可持续的生物催化和吸附系统提供了理论基础。

引言

生物催化在酯化反应中具有重要意义，它是制备香料、芳香剂和生物燃料等有用化合物的绿色方法[1]。生物催化利用生物来源的蛋白质作为催化剂，在不消耗自身的情况下高效催化反应[1]。在室温等温和条件下进行生物催化时，酶消耗的能量较少，产生的有毒副产物也较少。此外，生物催化过程对于特定底物具有高产率，从而减少了浪费并大幅降低了生产成本[2]。相比之下，传统催化通常使用强酸、强碱或含金属的催化剂，这些催化剂具有腐蚀性、毒性且难以处理[3]。脂肪酶是用于催化酯化反应的最常用酶之一[4,5]。尽管脂肪酶的主要生物功能是水解脂肪和油脂，但在适当的反应条件下，它们也能有效催化酯化、酯交换和醇解反应[6,7]。固定化酶系统的开发是该领域的重要进展，使脂肪酶在工业应用中更加稳定和实用[8]。在酶促酯化过程中，反应物在酶表面的吸附是一个关键步骤，它通常决定了反应速率和总产率，尤其是在非均相催化系统中[9,10]。

吸附是指由于分子间作用力，原子、离子或分子在两相界面处的积累现象，其中吸附物仅附着在吸附剂表面而不扩散到其内部[11,12]。这种表面相互作用在生物催化过程中至关重要，因为吸附的强度和程度决定了活性位点的可及性，进而影响酯键形成的效率[10,13]。除了生物催化之外，吸附还被认为是一种经济、高效且环境友好的污染物去除技术，尤其是在处理重金属污染的废水方面[14]。基于这种双重重要性，吸附研究不仅有助于深入理解酯化过程中的反应物-酶相互作用，还为生物催化转化与更广泛的环境应用提供了联系[15]。当酶被固定在树脂或其他固体载体上时，其表面性质和结合特性对吸附效率有显著影响[16]。固定化可以保持酶的三级结构稳定，防止其变性，从而使其能够在不同的反应循环中重复使用，提高了过程的经济性[17]。这创造了明确的界面环境，使底物扩散和表面吸附直接影响反应动力学[16]。载体材料的性质（如表面积、孔隙率、官能团和表面电荷）会影响底物与固定化酶的相互作用，这种相互作用通常受疏水性、静电作用或范德华力的支配[18]。因此，了解底物在固定化脂肪酶表面的吸附特性至关重要，这有助于优化反应条件、建立合适的动力学模型，并提高整体过程效率[19]。理解吸附的潜在机制有助于开发和完善动力学模型（如兰缪尔-欣谢尔伍德动力学模型），从而更有效地描述类似系统中的催化行为[20]。

尽管脂肪酶催化的酯化反应已得到广泛研究，但现有研究大多基于经验数据，重点在于优化反应参数，而非探究控制酶-底物相互作用的吸附现象[21,22]。最近的一些研究（如考察异丁基丙酸在CalB Immo Plus?上的吸附和脱附行为以及微生物脂肪酶在中孔疏水性树脂上的吸附）开始探讨固定化系统中的吸附机制[23,24]。然而，这些研究主要集中在产物形成和酶-载体相互作用上，而非底物吸附作为酯化反应的动力学决定因素。

迄今为止，关于丁醇和丁酸在丙烯酸树脂固定的脂肪酶上的吸附行为的研究还不够充分，尤其是对于通过酶促酯化生成丁基丁酸的过程。更重要的是，像兰缪尔-欣谢尔伍德（Langmuir-Hinshelwood, LH）动力学模型这样的机制模型的验证尚未在该系统中进行。尽管传统的米氏动力学（Michaelis–Menten kinetics）被广泛使用，但它们未能解释表面结合、底物竞争和特定于固定化酶的传质效应[25,26]。此外，尚未建立或考虑能够更准确反映酶-底物表面复杂性的酶促吸附模型。尽管人们对绿色生物加工的兴趣日益增加，但对吸附效率的环境评估（如E因子、全球变暖潜力（Global Warming Potential, GWP）和累积能量需求（Cumulative Energy Demand, CED）在吸附控制的酶促反应中的影响仍研究不足，这凸显了当前文献中的关键空白。

为填补这些空白，本研究的主要目的是验证兰缪尔-欣谢尔伍德（Langmuir-Hinshelwood, LH）动力学模型在描述丙烯酸树脂固定脂肪酶存在的吸附控制酶促酯化过程中的孔扩散机制方面的适用性。本研究的具体目标是验证类兰缪尔模型（Competitive Langmuir-like model）和ECA模型，以证实兰缪尔-欣谢尔伍德模型的必要和充分条件。

为此，采用了综合的实验和建模方法，包括：

• 1.
  比较多组分吸附等温线（如类兰缪尔模型）和针对酶特异性相互作用及表面异质性优化的新型酶促兰缪尔模型。
• 2.
  通过BET表面积分析、FT-IR、XRD、零电荷点（pH_PZC）和HRTEM对丙烯酸树脂固定的脂肪酶催化剂进行表征，以明确影响吸附行为的结构特征。
• 3.
  通过将表面表征数据与动力学建模相关联，对生物底物吸附和反应动力学进行机制解释。
• 4.
  基于E因子、全球变暖潜力（GWP）和累积能量需求（CED）等可持续性指标，对酯化系统的环境性能进行分析，以建立吸附效率与绿色工艺指标之间的联系。

本研究旨在提供一种新的方法，结合机制验证和实践见解，以设计高效且环境可持续的酶促酯化过程。

材料

该反应由固定在丙烯酸树脂中的重组脂肪酶催化（活性以黑曲霉表示，≥5,000 U/g），购自Sigma Aldrich（CAS编号：9001-62-1）。丁醇（CAS编号：71-36-3）和丁酸（CAS编号：107-92-6）是酯化反应的底物。所有化学品均为实验室级。分析级高纯度丁醇（CAS编号：71-36-3；纯度：≥99.8%）和丁酸（CAS编号：107-92-6；纯度：≥99%）用作校准标准。

固定化脂肪酶的物理表征

吸附

催化剂表征

使用Brunauer–Emmett–Teller (BET) 表面积分析、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和零电荷点（pH_PZC）测量方法，对吸附前后脂肪酶丙烯酸树脂的结构、表面和功能变化进行了全面检查。

结论

本研究结果表明，兰缪尔-欣谢尔伍德模型适用于描述使用丙烯酸树脂固定脂肪酶的吸附控制催化过程。BET、FTIR、XRD和PZC分析的结果证实了脂肪酶-树脂系统中的广泛结构和表面变化。此外，DFT–HK等温线显示，该系统具有由介孔和微孔区域组成的层次多孔网络。

作者贡献

所有署名的作者均做出了以下贡献：

1)

在工作的构思或设计方面做出了重要贡献：乌贾伊尼·萨克尔（Ujjaini Sarkar）；或在数据获取、分析或解释方面做出了贡献：德布利娜·森古普塔（Deblina Sengupta）；或在数据获取、新软件的开发方面做出了贡献：德布利娜·森古普塔（Deblina Sengupta）和沙莫伊塔·达塔（Shamoyita Datta）；

2)

撰写了初稿：德布利娜·森古普塔（Deblina Sengupta）；或对重要内容进行了批判性修订：乌贾伊尼·萨克尔（Ujjaini Sarkar）；

3)

批准了最终版本：

CRediT作者贡献声明

德布利娜·森古普塔（Deblina Sengupta）：撰写初稿、验证、软件开发、方法学研究、数据整理。沙莫伊塔·达塔（Shamoyita Datta）：撰写初稿、数据可视化、软件开发。乌贾伊尼·萨克尔（Ujjaini Sarkar）：审稿与编辑、项目管理、资源协调、方法学研究、资金获取、数据分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益和个人关系：

乌贾伊尼·萨克尔（Ujjaini Sarkar）与贾达普尔大学存在雇佣关系。如果还有其他作者，他们声明没有其他可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。

致谢

第一作者衷心感谢通过全印度技术教育委员会（All India Council for Technical Education）的AICTE博士奖学金（ADF）计划获得的财政支持（ADF信件编号：ADF/FET/PRE-Ph.D/03/2021-22，日期：2021年12月9日）。作者还感谢拉吉夫·甘地石油技术学院（Rajiv Gandhi Institute of Petroleum Technology, RGIPT）的中央仪器设施（Central Instrumentation Facility, CIF）提供的支持，该机构位于巴哈杜尔普尔穆克赫蒂亚莫雷（Mubarakhpur Mukhetia More），贾伊斯（Jais），哈尔班什甘杰（Harbanshganj），阿梅蒂（Amethi）——229304。