《Nature Communications》：Tuning evolvability via plasmid copy number and regulatory architecture
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本研究针对合成基因回路在进化压力下易失活的问题，通过结合计算模型与体内诱变实验，揭示了质粒拷贝数(PCN)与调控架构如何协同影响表型突变率。研究发现，高PCN虽能促进功能获得性突变，但会抑制功能丧失性突变；同时，调控区突变比编码区突变更易在表型上显现。该研究为设计兼具进化稳定性和进化能力的生物回路提供了关键设计原则。
在合成生物学的宏伟蓝图中，科学家们正致力于将工程学原理应用于生命系统，设计出能够执行复杂逻辑运算、生产高价值化合物乃至作为活体药物的基因回路。然而，这些精心设计的“生物机器”与冰冷的电子元件有一个根本性的不同：它们会进化。突变是生命体不可避免的宿命，它如同一把双刃剑，既能带来新的功能，也可能导致精心设计的回路功能丧失，最终导致设计失败。因此，如何平衡基因回路的进化能力（Evolvability）与进化稳定性（Evolutionary stability），成为了合成生物学领域亟待解决的核心挑战之一。
基因回路通常被部署在质粒（Plasmid）上，这种染色体外的DNA分子可以独立复制，其拷贝数（Plasmid Copy Number, PCN）决定了基因的剂量。高拷贝数质粒虽然能提供更多的基因模板，理论上增加了突变发生的“靶点”，但同时也带来了更复杂的细胞内环境。目前，我们对于质粒拷贝数如何与基因回路的调控架构（Regulatory architecture）相互作用，共同塑造一个细胞群体的进化轨迹，仍缺乏系统性的理解。
为了回答这一关键问题，来自纽约大学阿布扎比分校的Ximing Li和Andras Gyorgy团队在《Nature Communications》上发表了一项重要研究。他们通过巧妙的实验设计和严谨的计算模拟，揭示了质粒拷贝数与调控架构如何协同调控表型突变率，为设计进化鲁棒性更强的合成基因回路提供了关键的设计原则。
关键技术方法
为了系统研究质粒拷贝数对表型突变率的影响，研究人员采用了多学科交叉的研究策略。他们首先构建了一个改进的Wright-Fisher模型，用于模拟质粒在细胞分裂过程中的突变、复制和分配过程。在实验层面，他们利用EvolvR系统（一种由CRISPR引导的易错DNA聚合酶）在体内对特定基因位点进行定点诱变。为了精确控制基因表达水平，他们引入了基于非相干前馈环（IFFL）的控制模块，确保在不同质粒拷贝数下，目标蛋白的表达量保持恒定。此外，研究还利用了流式细胞术（Flow cytometry）和波动分析（Fluctuation analysis）来精确量化表型突变率，并通过全基因组测序（Whole genome sequencing）和纳米孔测序（Nanopore sequencing）对突变体进行了基因型验证。
研究结果
1. 表型突变率取决于基因剂量
研究人员首先通过计算模拟预测，随着质粒拷贝数（PCN）的增加，携带至少一个突变质粒的细菌亚群数量会增加，但每个突变细胞内突变质粒的比例反而会下降。为了验证这一预测，他们构建了一个简单的遗传回路，利用EvolvR系统靶向一个带有缺陷的sfGFP基因，使其恢复功能。实验结果表明，表型突变率确实随着PCN的增加而增加，证实了基因剂量对突变供给的正面贡献。
2. 基因调控影响表型突变率
为了排除PCN变化导致蛋白表达量变化带来的干扰，研究人员引入了IFFL控制模块，将目标蛋白的表达量与PCN解耦。在这种情况下，他们发现表型突变率与PCN的关系变得复杂。当检测阈值较低时（如抗生素抗性筛选），突变率随PCN增加而增加；但当检测阈值较高时（如荧光强度），突变率随PCN增加先升高后降低。这表明，PCN通过影响突变供给和单个突变质粒的表达强度，共同决定了表型突变率。
3. 功能丧失性表型突变率随基因剂量增加而降低
接下来，研究人员研究了功能丧失性突变。他们构建了一个由LacI抑制的sfGFP表达系统，并利用EvolvR靶向LacI基因使其失活。实验结果显示，随着PCN的增加，表型突变率反而显著下降。这是因为在高PCN下，即使部分LacI基因发生突变，细胞内仍有大量功能正常的LacI蛋白可以补偿，从而抑制了突变表型的显现。
4. 编码区突变在表型水平被掩盖，而调控区突变随PCN增加而更显著
最后，研究人员比较了突变发生在编码区（LacI基因）和调控区（LacI结合位点）的不同效果。他们发现，当突变发生在编码区时，高PCN会增强野生型蛋白的补偿效应，从而掩盖了突变表型，导致表型突变率随PCN增加而降低。相反，当突变发生在调控区时，即使只有一个质粒的启动子发生突变，也能不受其他野生型质粒的影响而表达蛋白，因此表型突变率随PCN增加而显著增加。这一规律在组成型表达和自抑制（Self-repressed）两种调控架构下均成立。
结论与讨论
这项研究通过整合计算模型与体内诱变实验，系统地揭示了质粒拷贝数（PCN）与调控架构如何协同调控表型突变率。研究结果表明，PCN对表型突变率的影响并非一成不变，而是取决于突变的性质（功能获得性 vs. 功能丧失性）和突变发生的位置（编码区 vs. 调控区）。具体而言，高PCN有利于功能获得性突变和调控区突变的显现，但会抑制功能丧失性突变和编码区突变的显现。
这些发现与遗传显性（Genetic dominance）的概念高度吻合。功能获得性突变通常被认为是显性的，而功能丧失性突变则被认为是隐性的。本研究证实，基因剂量与显性突变呈正相关，与隐性突变呈负相关。此外，调控区突变通常被认为是共显性的，这也解释了为什么它们在高PCN下更容易显现。
该研究的意义在于，它为合成生物学家提供了明确的设计指南。通过合理选择质粒拷贝数和调控架构，我们可以精确调控基因回路的进化能力。例如，在设计需要长期稳定表达的基因回路时，应选择高拷贝数质粒，并利用负反馈等调控机制来抑制功能丧失性突变的显现；而在进行定向进化时，则应选择高拷贝数质粒，并靶向调控区，以加速有益突变的产生。这项研究不仅深化了我们对生命系统进化规律的理解，也为设计下一代进化鲁棒性更强的合成生物系统奠定了坚实的理论基础。
