《Nature Communications》：SigmaR1 is an auxiliary translocon factor with lipid-binding activity that regulates protein and lipid droplet homeostasis
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本研究揭示了Sigma非阿片类细胞内受体1(SigmaR1)作为内质网片层特异性蛋白，通过其N端短区域靶向并与易位子复合物组分（如TRAPα和Nicalin）直接互作，其C端β-桶结构直接结合磷脂酰胆碱(PC)并增强与易位子的关联。SigmaR1缺失破坏蛋白质和脂质稳态，导致肝细胞脂滴积累，为理解其广泛生理病理功能提供了新机制。
在细胞这座精密运转的"城市"中，内质网(Endoplasmic Reticulum, ER)如同一个多功能制造中心，负责蛋白质合成、脂质代谢等重要生命活动。这个膜系统呈现出两种独特的形态结构：平坦的片层(ER sheets)和弯曲的管状结构(ER tubules)。其中，粗糙内质网(rough ER)即富含核糖体的片层结构，是蛋白质合成的主要场所，其平坦特性为庞大的膜结合多核糖体及易位子复合物(translocon complex)提供了理想的工作平台。然而，调控这些功能性膜域特化的分子机制，尤其是蛋白质如何精确靶向并驻留在特定ER区域，仍是领域内待解的关键问题。
Sigma非阿片类细胞内受体1(SigmaR1)是一种能与多种精神类药物相互作用的受体，在神经、内分泌和免疫系统中扮演重要角色，其突变与运动神经元病等相关。尽管其生理重要性日益凸显，但SigmaR1的精确亚细胞定位及其分子功能长期以来缺乏清晰界定。发表在《Nature Communications》的这项研究，首次系统阐明了SigmaR1作为ER片层驻留蛋白，通过直接结合易位子组分和磷脂，在维持细胞蛋白质和脂质稳态中发挥核心作用。
研究团队综合运用了多种关键技术方法：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建内源性sfGFP-SigmaR1敲入(knock-in)细胞系进行定位研究；利用大鼠肝脏组织分级分离和蔗糖密度梯度离心验证亚细胞分布；采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, CoIP)结合质谱分析(Mass Spectrometry, MS)筛选互作蛋白，并通过体外GST pull-down和荧光寿命成像显微术(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM)验证直接互作；通过非靶向脂质组学(LC-MS/MS)和体外蛋白-脂质共迁移实验分析脂质结合特性；利用蛋白质组学分析SigmaR1敲除(knockout, KO)细胞的全局蛋白变化；并通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察超微结构。研究还使用了小鼠原代肝细胞进行功能验证。
SigmaR1是ER片层蛋白
研究人员首先通过高分辨率共聚焦显微镜观察发现，SigmaR1-GFP与ER片层标志物Sec61β强烈共定位，而与管状标志物Reticulon-4、Reep5和Tex2共定位较弱。为避免过表达假象，他们利用CRISPR-Cas9技术在HeLa细胞中内源性标记了SigmaR1的N端，构建了sfGFP-SigmaR1敲入细胞系。活细胞和免疫荧光成像均证实内源性SigmaR1优先富集于ER片层。大鼠肝脏组织分级分离实验进一步提供了独立的生物化学证据：内源性SigmaR1主要富集于粗糙ER组分（第3、4、5份），与ER片层蛋白Sec61β和Calnexin分布一致，而与管状标志物Reticulon-4和Reep5无重叠。有趣的是，用嘌呤霉素(Puromycin)破坏多聚体或用放线菌酮(Cycloheximide)中止肽链延伸均不影响SigmaR1的定位，表明其靶向不依赖于多聚核糖体。更重要的是，饥饿诱导的ER片层扩张在SigmaR1缺失后被显著抑制，提示SigmaR1在应激条件下ER形态重塑中的关键作用。
N端短区域促进SigmaR1的ER片层定位
为解析靶向机制，研究确认了SigmaR1是II型整合膜蛋白，N端在胞质侧，C端在腔膜侧。通过截断体分析发现，包含跨膜结构域(Transmembrane Domain, TM)的N端区域（第1-30位氨基酸，SigmaR1-NT）足以介导ER片层定位，而仅含TM结构域（第10-30位氨基酸，SigmaR1-TM）的构建体则无法靶向片层。进一步缺失实验表明，N端第2-8位氨基酸残基至关重要，其缺失（SigmaR1△2-8）完全破坏了特异性靶向。嵌合体实验证明，将SigmaR1-NT融合到管状ER蛋白Tex2的截断体上，可将其重定向至ER片层，而仅融合第2-8位短肽则无效，说明短肽序列和TM结构域均为高效靶向所必需。
SigmaR1直接与易位子复合物相互作用
为探究功能意义，研究人员通过SigmaR1-GFP的免疫共沉淀-质谱分析筛选互作蛋白。功能富集分析显示，SigmaR1相互作用蛋白显著富集于ER相关组分和代谢通路。质谱结果鉴定出多个易位子组分，如TRAPα、Nicalin、SEC11A、CCDC47、TMEM147、NOMO1、RRBP1、TRAM1和TMCO1。免疫荧光证实除TRAM1外，这些蛋白均与SigmaR1在ER片层强共定位。GFP-Trap实验验证了SigmaR1与Halo标记的Nicalin、TRAPα、SEC11A、TMEM147、NOMO1和TMCO1，以及GFP标记的RRBP1和TRAM1存在相互作用。在内源性水平，sfGFP-SigmaR1敲入细胞的免疫共沉淀进一步证实了与Nicalin、TRAPα、SEC11A和CCDC47的特异性结合，而与TMEM147结合较弱。重要的是，缺失第2-8位氨基酸严重削弱了与内源性Nicalin的相互作用。体外GST pull-down实验直接证明GST-SigmaR1能与His-Nicalin和His-TRAPa直接结合，但不与His-SEC11A或His-CCDC47结合。使用纯化的His-Flag-SigmaR1与GFP-TRAPa/GFP-Nicalin进行的体外pull-down再次验证了直接相互作用，且此结合依赖于N端第2-8位氨基酸。蔗糖梯度离心显示内源性SigmaR1与易位子组分Nicalin和TRAPa共富集于核糖体结合的ER片层组分，且GFP-Trap证实相互作用特异性地发生在此区域。FLIM分析进一步支持SigmaR1与Nicalin存在直接特异性相互作用，而与Sec61β虽共富集但无直接结合。这些结果共同表明SigmaR1是易位子机器的辅助组分。
SigmaR1通过C端β-桶结构结合PC
结构分析提示SigmaR1 C端包含一个杯状β-桶结构，其宽大、平坦且疏水的膜近端表面可能作为脂质结合位点。对内源性SigmaR1敲入细胞系的非靶向脂质组学分析显示，SigmaR1与多种磷脂结合，尤其显著偏好磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine, PC)。分子对接模拟支持PC与三聚体SigmaR1的β-桶存在有利的结合模式。体外蛋白-脂质共迁移实验证实，去除TM结构域的GST-SigmaR1△TM能直接与NBD标记的PC、磷脂酸(Phosphatidic Acid, PA)和磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)共迁移，但不与胆固醇、PE或神经酰胺结合。缺失ER片层靶向能力的GST-SigmaR1△2-30仍保留脂质结合能力但亲和力降低，而仅含β-桶结构域（第80-168位氨基酸）的截断体也能结合脂质。通过将β-桶中保守小疏水残基替换为庞大色氨酸，构建了四个空间填充突变体（Mut1-4），其中Mut2（104V, 105L, 106L, 107F→W）对脂质结合的削弱最显著。脂质体共沉淀实验进一步证实，GST-SigmaR1能被蔗糖负载的脂质体沉淀，而Mut2突变体则不能，确证脂质结合由β-桶介导。功能上，体外pull-down显示PC结合增强了SigmaR1与Nicalin和TRAPa的相互作用，提示脂质结合动态调节其与易位子的关联。
SigmaR1敲除损害细胞蛋白质稳态
鉴于SigmaR1与易位子的直接互作，研究者在SigmaR1敲除HeLa细胞中探究其蛋白质稳态功能。SigmaR1缺失并未影响其他易位子组分水平，但显著增加了eIF2α的磷酸化水平，表明细胞处于应激状态，整体翻译受抑制。值得注意的是，这种效应并非由ER应激间接引起，因为SigmaR1缺失既未诱导也未增强毒胡萝卜素(Thapsigargin)触发的ER应激（如分子伴侣BiP水平和ER涡旋结构未变）。定量蛋白质组学显示，SigmaR1缺失导致核糖体相关蛋白显著下调，KEGG分析还提示其在脂代谢、感染性疾病、神经退行性疾病等多条通路中发挥作用。救援实验表明，回补野生型SigmaR1-GFP能有效恢复全局蛋白质稳态，特别是核糖体通路；而缺失N端（靶向缺陷）或脂质结合突变体均无法完全挽救表型，强调了ER片层定位和脂质结合对其功能的重要性。
SigmaR1缺失导致肝细胞脂滴积累
意外发现，小干扰RNA(siRNA)敲低SigmaR1后，在油酸(Oleic Acid, OA)刺激下，人肝癌细胞系HepG2出现显著的脂滴(Lipid Droplets, LDs)积累，细胞内甘油三酯(Triglyceride, TG)和胆固醇水平显著升高。此表型在Huh7细胞系和小鼠原代肝细胞中得到验证。透射电镜显示SigmaR1敲低的HepG2细胞中LDs直径显著增大而非数量增加。回补SigmaR1-GFP或sfGFP-SigmaR1能有效挽救LD积累表型。功能域分析表明，回补缺失脂质结合域(SigmaR1△81-160)、脂质结合缺陷突变体(Mut2)或ER片层靶向缺陷突变体(SigmaR1△2-8)均不能完全逆转LD异常。值得注意的是，敲低其他已知ER片层因子（如p180/RRBP1、Climp63）对LD动态影响较小，而驱动蛋白接头蛋白Kinectin敲低虽引起LD积累但程度轻于SigmaR1敲低，提示SigmaR1缺失导致的LD缺陷并非单纯由ER片管比例改变引起，SigmaR1在脂质储存中可能具有更直接、独特的作用。
研究结论与意义
本研究确立了SigmaR1作为II型ER整合膜蛋白特异性富集于ER片层，其定位由N端短肽介导并促进与特定易位子组分（如TRAPα和Nicalin）的直接相互作用。同时，SigmaR1 C端β-桶结构能结合PC等磷脂，此结合增强了其与易位子的关联。功能上，SigmaR1缺失系统性破坏了蛋白质和脂质稳态，导致肝细胞脂滴积累。研究者提出工作模型：富集于ER片层的SigmaR1作为易位子复合物的动态辅助因子，其PC结合能力调控与易位子的互作，进而可能通过促进核糖体与粗糙ER的结合来调节易位子活性，最终维持蛋白质和脂质稳态。这一模型将SigmaR1在ER形态发生中的作用与其在共翻译蛋白质转运这一ER片层核心功能联系起来，为理解其广泛的生理病理功能提供了新视角。特别值得注意的是，SigmaR1对LD动态的调控在肝细胞中最为显著，这与肝脏在脂质合成、储存和分泌中的核心地位相符，也提示SigmaR1可能成为代谢性肝病（如非酒精性脂肪肝）的潜在治疗靶点。研究整合了细胞生物学、生物化学、蛋白质组学和脂质组学等多学科技术，揭示了ER形态、蛋白质转运和脂代谢之间的新型功能联结，为深入探索细胞器功能调控和相关疾病机制开辟了新方向。
