《Applied Phycology》：Utilization of Phaeodactylum tricornutum cultured with different commercial fertilizers for enhancing growth and immune response of tiger shrimp larvae
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本文探讨了利用不同商品肥（CON、PBB、PBR、PKP、PKA）培养的三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）对斑节对虾（Penaeus monodon）幼体生长及免疫应答的影响。研究发现，PBB和PKA培养基培养的微藻在生长速率和总类胡萝卜素含量上与对照（CON）相当，且能显著抑制弧菌（Vibrio spp.）生物膜形成，效果与抗生素链霉素相当。在幼体养殖实验中，投喂PBB处理组微藻的对虾在弧菌攻毒后表现出更强的呼吸爆发活性和更高的存活率（83.33%），表明PBB肥料能有效提升微藻品质，进而增强斑节对虾对弧菌感染的抵抗力。
研究背景与目的
斑节对虾（Penaeus monodon）是印度尼西亚主要的水产养殖品种，具有极高的经济价值。然而，弧菌病（Vibriosis）是导致对虾各阶段大规模死亡的主要细菌性疾病之一。目前，控制弧菌病最常用的方法是使用化学品和抗生素，但这可能导致细菌耐药性、环境污染以及虾产品中药物残留，对人类消费产生不利影响。因此，寻找安全、环保的弧菌病控制方法至关重要。
微藻作为一种天然产物，含有丰富的生物活性物质，是替代抗生素的理想选择。其中，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）因其富含多不饱和脂肪酸（如EPA）和类胡萝卜素（如岩藻黄素）而备受关注。这些物质不仅具有抗菌活性，还能增强宿主的免疫反应。微藻的营养成分和生物活性物质与其生长培养基的营养成分密切相关。因此，本研究旨在评估使用五种不同商品肥（CON、PBB、PBR、PKP、PKA）培养的三角褐指藻，对斑节对虾幼体生长性能和免疫应答的改善作用。
材料与方法
实验设计
本研究于2022年9月至2023年5月在印度尼西亚南苏拉威西省马罗斯县咸水水产养殖与渔业推广研究中心进行。实验材料为3000尾平均体重0.14 ± 0.02 g的斑节对虾幼体。实验菌株为副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）MP275、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）MP275和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）MP275。实验所用三角褐指藻和肥料均来自印度尼西亚科学机构海洋学研究中心。
微藻培养与代谢物提取
三角褐指藻在15 L无菌培养基中培养7天，培养基分别为CON（Conway）、PBB（Conway + 生物硅）、PBR（Balai Rica）、PKP（专利商品肥）和PKA（Asnita商品肥）。每天观察并计数微藻密度。在微藻达到指数生长期时，收集上清液，通过离心、乙酸乙酯萃取、蒸发浓缩等步骤提取代谢物，用于后续体外抑菌实验。
体外抑菌与抗生物膜活性测试
采用纸片扩散法测定微藻提取物对三种弧菌的抑菌圈大小。抗生物膜活性测试则通过将细菌悬液与微藻提取物在96孔板中孵育48小时，使用结晶紫染色法测定生物膜形成量，并以链霉素作为阳性对照。
幼体养殖与攻毒实验
斑节对虾幼体在30 L水体中饲养30天，每5天投喂一次不同肥料培养的三角褐指藻。实验分为K（空白对照）、CON、PBB和PKA四个处理组，每组设三个重复。饲养结束后，进行弧菌攻毒实验，通过浸泡法将幼体暴露于107CFU ml?1的副溶血性弧菌和哈维氏弧菌中，观察其存活率。
测定指标
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微藻指标：密度、比生长率、生物量、总类胡萝卜素含量。
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免疫指标：总血细胞数（THC）、呼吸爆发活性、酚氧化酶（PO）活性。
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生长性能：初始体重、终末体重、增重、特定生长率（SGR）、存活率。
结果与分析
不同肥料对三角褐指藻生长及类胡萝卜素含量的影响
实验结果显示，不同肥料处理对三角褐指藻的生长和代谢产物积累有显著影响。在培养第5天，CON、PBB和PKA处理组的微藻密度和比生长率显著高于PBR和PKP处理组（p < 0.05）。其中，PBB处理组的微藻生物量最高（p < 0.05）。在总类胡萝卜素含量方面，CON、PBB和PKA处理组也显著高于其他处理组（p < 0.05）。这表明PBB和PKA肥料能够为三角褐指藻提供充足的营养，支持其快速生长和类胡萝卜素的高效合成。
微藻提取物的抗菌及抗生物膜活性
体外实验表明，所有肥料培养的三角褐指藻提取物均能抑制弧菌的增殖。抗生物膜测试结果显示，微藻提取物能显著抑制副溶血性弧菌、哈维氏弧菌和溶藻弧菌的生物膜形成。其中，PBB和PKA处理组的抗生物膜活性与抗生素链霉素处理组无显著差异（p > 0.05），而副溶血性弧菌的抑制活性最高，与其他处理组存在显著差异（p < 0.05）。这表明三角褐指藻虽然不能直接杀死弧菌，但能有效阻止其形成生物膜，从而降低其致病性。
斑节对虾幼体的生长性能
经过30天的饲养，投喂三角褐指藻的对虾幼体在生长性能上表现出显著差异。虽然各处理组间的存活率无显著差异（p > 0.05），但PBB处理组的终末体重、增重和特定生长率均显著高于其他处理组（p < 0.05）。这表明投喂PBB肥料培养的三角褐指藻能有效促进斑节对虾幼体的生长。
斑节对虾幼体的免疫应答与攻毒后存活率
免疫指标测定结果显示，在攻毒前和攻毒后，各处理组的总血细胞数（THC）无显著差异（p > 0.05），但所有处理组在攻毒后均有所增加。攻毒后，PKA处理组的呼吸爆发活性最高，显著高于其他处理组（p < 0.05）。酚氧化酶（PO）活性在攻毒后也表现出显著差异，CON、PBB和PKA处理组的值均高于其他处理组（p < 0.05）。
攻毒实验的存活率结果最为关键。攻毒后第4天，PKA和CON处理组的累积存活率开始下降，而其他处理组仍保持在100%。到第6天和第7天，CON和PKA处理组出现100%死亡。最终，PBB处理组的累积存活率高达83.33%，显著高于其他攻毒处理组（p < 0.05）。所有未攻毒的阴性对照组均无死亡记录。这表明投喂PBB肥料培养的三角褐指藻能显著增强斑节对虾幼体对弧菌感染的抵抗力。
讨论
本研究证实，肥料类型显著影响三角褐指藻的生长、生物量和类胡萝卜素含量。CON、PBB和PKA处理组之所以表现出更高的生长速率，可能与其培养基中氮、磷、硅等营养元素的充足供应有关。氮元素直接参与蛋白质合成和光合作用，对微藻生长和类胡萝卜素等代谢产物的合成至关重要。
三角褐指藻富含类胡萝卜素，如岩藻黄素。类胡萝卜素在生物体内具有多种功能，包括增强消化代谢、缩短蜕皮周期以及通过抑制NADPH还原酶活性来减少氧化应激。这些机制最终有助于提高能量效率和生物合成，从而支持对虾的生长。
体外实验发现，三角褐指藻提取物虽不能直接抑制弧菌生长，但能有效抑制其生物膜形成。生物膜的形成受营养可用性的影响，而微藻的代谢活动与营养浓度密切相关。研究表明，氮和硅的添加可以促进三角褐指藻中岩藻黄素的合成，而氮和磷的富集则显著影响其抗菌和抗生物膜特性。因此，三角褐指藻的抗生物膜活性很可能与其在特定营养条件下合成的类胡萝卜素等生物活性物质有关。
在幼体养殖实验中，投喂三角褐指藻，特别是PBB处理组，显著提高了对虾的免疫反应和攻毒后的存活率。这主要归因于微藻中的生物活性物质，尤其是类胡萝卜素。类胡萝卜素能够提高总血细胞数、酚氧化酶活性和呼吸爆发活性，从而增强对虾的非特异性免疫力。PBB处理组之所以效果最佳，可能是因为其培养基中的硅元素不仅促进了微藻的生长，还增强了微藻的生物活性，从而为对虾提供了更强的保护力。
结论
本研究证明，使用不同商品肥培养三角褐指藻，能显著影响其生长、总类胡萝卜素含量和抗生物膜活性。其中，PBB（Balai Biosilika）肥料培养的微藻效果最佳。投喂该微藻能有效促进斑节对虾幼体的生长，并显著增强其免疫应答能力，使其在弧菌攻毒后获得高达83.33%的存活率。这为开发安全、环保的弧菌病控制方法提供了新的思路，即在微藻培养阶段通过优化营养供给，提升其作为功能性饲料添加剂的价值，从而替代抗生素在水产养殖中的应用。
