《Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology》：Cross-talk between diabetic nephropathy and bone loss: PBMCs-guided discovery of NLRP3-inflammatory signalling
糖尿病肾病与骨丢失的交互对话：PBMCs引导的NLRP3炎症信号发现
摘要
糖尿病肾病（DN）是终末期肾病的主要驱动因素，同时会增加骨质疏松（OP）及其临床前兆——低骨密度（low BMD）的风险，这表明了其更广泛的系统性影响。尽管外周血单个核细胞（PBMCs）参与这两种疾病过程，但其共同机制仍知之甚少。本研究旨在通过分析患有这两种疾病的患者的转录组数据集，识别连接DN与OP/low BMD的共同生物标志物和通路。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）、机器学习和差异表达验证，我们确定NLRP3为一个核心枢纽基因。功能分析将NLRP3与促炎通路和免疫细胞活化联系起来。单细胞数据显示NLRP3在DN患者巨噬细胞中特异性过表达，这些巨噬细胞表现出增强的破骨细胞分化能力。蛋白质分析证实了DN病例中NLRP3水平升高。总之，患有骨质疏松并发症的DN患者的PBMCs显示出NLRP3表达上调和炎症小体活化，这可能驱动系统性炎症和骨丢失。这些结果阐明了DN与OP/low BMD之间的病理联系，并突显了NLRP3作为潜在诊断标志物和治疗靶点。
引言
随着全球人口迅速老龄化，糖尿病的患病率逐年上升。糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见的长时期微血管并发症之一，以进行性蛋白尿为特征，是导致终末期肾病（ESRD）的主要原因。DN是糖尿病性骨质疏松（DNOP）的危险因素，DNOP是一种以低骨密度（low BMD）和骨微结构损伤为特征的代谢性骨病。患有DNOP的患者表现出骨代谢受损和骨矿物质密度降低，使其更容易发生骨折和其他严重的骨科并发症。
外周血单个核细胞（PBMCs）来源于骨髓中的造血干细胞，在血液中循环并存在于外周组织中，包括肾脏和骨骼。PBMCs与多种复杂疾病如骨质疏松、糖尿病肾病和炎症有关。作为破骨细胞的前体，PBMCs是成人破骨细胞的唯一来源。在糖尿病肾病患者的肾脏中，单核细胞或巨噬细胞被发现可促进促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α， TNF-α）的释放，导致单核细胞和巨噬细胞浸润到肾小球基底膜，加剧肾脏炎症、氧化应激和肾小球基底膜损伤。
尽管PBMCs在DN和low BMD中都起着关键作用，但它们在DN-OP共病（DNOP）中的具体功能仍不清楚。为了弥补这一空白，我们对来自DNOP患者的PBMCs转录组数据进行了整合的生物信息学分析。通过利用WGCNA、机器学习和多样本整合，我们旨在识别稳健的生物标志物和分子靶点，从而为诊断和治疗提供新的见解。
方法
通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别潜在模块基因
对GEO数据集GSE142153和GSE56815使用WGCNA R包（v1.72.5）进行分析，以识别与DN和Low BMD相关的基因模块。
差异基因表达分析
使用R（v4.3.3）中的limma包（v3.60.4）进行差异表达基因（DEGs）分析，以识别在DN与正常组、Low BMD与正常组之间显著改变的基因（|log2倍数变化| > 0.27, P值 < 0.05）。
GO/KEGG富集注释
对从低骨密度（BMD）患者与健康对照者的PBMCs中鉴定出的DEGs进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。
通过机器学习算法检测特征基因
对DN组和Low BMD组之间共享的10个基因集进行全面的机器学习分析。使用了R软件中的Caret包，并采用了10折交叉验证策略。选择随机森林算法作为基础模型，并使用受试者工作特征曲线下面积（AUC）作为主要评估指标。使用Shapley加性解释（SHAP）框架来理解输入特征在模型预测中的相对重要性。
基于枢纽基因表达的NLRP3水平亚组分析
根据枢纽基因表达水平（高 vs. 低）对患者组织样本进行分层，使用中位表达值作为分界点。随后进行基因集富集分析（GSEA）。使用“GSVA”包（v1.52.3）对23个免疫相关基因集进行GSVA分析。
通过单细胞转录组数据分析进行验证
使用“Seurat”包（v5.1.0）分析GSE23315单细胞RNA测序数据。进行细胞质量控制，并使用二维均匀流形近似和投影（UMAP）图可视化所有细胞的基因表达相似性。
患者招募细节
患者招募自莆田学院附属医院肾病科。通过医院的电子病历系统识别诊断为糖尿病肾病的患者，随后筛选伴有或不伴有骨质疏松的患者。研究人员向潜在参与者详细解释了研究目的、程序和风险，在获得书面知情同意后纳入符合条件的个体。
蛋白质印迹法（Western Blotting）
使用密度梯度离心法从12名DN患者（6名骨密度正常，6名骨质疏松）中分离PBMCs。使用RIPA缓冲液提取总蛋白，通过BCA法定量，并通过12% SDS-PAGE分离蛋白质。
结果
识别与DN和low BMD患者相关的共表达基因模块
本研究的工作流程如图1A所示。对包含10名健康捐献者和30名糖尿病肾病患者的PBMCs的GSE142153数据集的WGCNA分析，鉴定出16个与DN相关的基因模块（图1B-D）。MEgreenyellow模块被发现与DN呈正相关（r = 0.44, p = 2.5e-07），因此确定了339个基因作为关键模块进行进一步研究。类似地，对包含20名绝经前高BMD女性和20名绝经前低BMD女性组的人PBMCs的GSE56816数据集的WGCNA分析，鉴定出11个与糖尿病相关的基因模块（图1E-G）。MEbrown模块被发现与Low BMD呈正相关（r = 0.32, p = 4.3e-23），并被选为具有452个基因的关键模块用于进一步分析。
识别糖尿病肾病GSE142153数据集和骨质疏松GSE56816数据集中的共同DEGs
我们对DN和Low BMD患者（相对于健康对照）的PBMCs进行了严格筛选，分别鉴定出748个和525个差异表达基因，命名为DN_DEGs和Low BMD_DEGs。维恩图交集显示，有10个基因（KLK3, ARL4C, NLRP3, BMI1, AGER, EGR3, OXSR1, CYHR1, RGS19, TUBGCP2）在Brown模块、Greenyellow模块、DN_DEGs和Low BMD_DEGs中共享，所有基因的倍数变化≥1.2且p值<0.05（图2A）。此外，火山图分别显示了这10个基因在DN和Low BMD患者PBMCs中的表达情况（图2B，D）。使用山脊图可视化并比较这10个基因在两组间的表达分布差异（图2C，E）。为了进一步分析这10个交集基因的生化功能和生物学意义，我们检查了它们在染色体上的分布（图2F），并使用GeneMANIA数据库探索了它们的蛋白质功能关联（图2G）。还使用着色方案检查了共享基因之间的相关性，蓝色表示正相关，红色表示负相关（图2H）。使用GO和KEGG对10个基因进行功能分析以识别潜在的作用机制。GO富集分析揭示了它们在T细胞活化正调控、白细胞细胞间粘附、淋巴细胞活化和细胞间粘附（生物过程，BP）中的作用；涉及PRC1复合物、细胞分裂位点、核泛素连接酶复合物、PcG蛋白复合物、经典炎症小体复合物和γ-微管蛋白复合物（细胞组分，CC）；与泛素-蛋白质转移酶激活剂活性、肽聚糖结合、内肽酶激活剂活性、S100蛋白结合、微管负端结合和GTP酶活性（分子功能，MF）相关（图2I）。KEGG富集分析揭示了细胞过程，特别是坏死性凋亡和调节干细胞多能性的信号通路（图2J）。
使用机器学习算法筛选DN和low BMD患者PBMCs的候选诊断生物标志物
通过为每个基因构建ROC曲线来评估10个共享基因在DN和Low BMD患者PBMCs中的诊断效用。结果表明，10个基因各自ROC曲线的AUC值未达到0.85的较高诊断阈值（图3A，B）。多机器学习结果表明，广义加性模型在区分GSE142153中的糖尿病肾病与健康对照方面表现出色，测试数据集的ROC值达到0.932（图3C）。随机森林模型在区分GSE56816中的Low BMD和high BMD方面表现出相当的效力，测试数据集的ROC值为0.9（图3D）。
为了阐明个体特征对模型性能的贡献，使用DALEX包进行了特征重要性分析。对于应用于GSE142153数据集（DN组）的广义加性模型，NLRP3、TUBGCP2和OXSR1成为最具影响力的特征（图3E）。相比之下，用于GSE56816数据集（Low BMD组）的随机森林模型将OXSR1、NLRP3、TUBGCP2、ARL4C和KLK3确定为最关键的特征，按重要性降序排列（图3F）。此外，Shapley值分析显示TUBGCP2和NLRP3是DN组的主要贡献者（图3G），而NLRP3成为Low BMD组的主导因素（图3H）。与其他算法的比较分析确定NLRP3是DN组和Low BMD组潜在的共享生物标志物。
NLRP3作为DN和low BMD候选生物标志物的诊断性能和表达谱
下一步是研究NLRP3在DN和Low BMD发病机制中的潜在作用。在DN组和Low BMD组中，统计分析显示NLRP3表达水平 consistently高于健康对照组（图4A，B）。ROC曲线和相应的AUC值表明，与Low BMD模型相比，NLRP3在DN模型中具有更好的分类性能（补充文件1 – 图S1A，B）。这些结果表明NLRP3可能是诊断DN和Low BMD的有前景的生物标志物。
NLRP3作为与肾功能和肾病相关的枢纽基因在Nephroseq数据库中的分析
Nephroseq数据库是肾脏组织样本的综合数据库，为肾脏研究提供基因表达和临床数据，本研究应用数据挖掘来检查Nephroseq数据库中可用样本的NLRP3表达与DN患者肾功能之间的相关性。分析显示，DN患者骨髓和脊髓组织中的NLRP3表达水平高于肾皮质和肾髓质（图4C，D）。在DN患者中观察到NLRP3表达的显著性别差异，男性水平高于女性（图4E）。临床检查和高通量测序/基因芯片数据库分析显示，DN患者的NLRP3水平与血压、年龄和体重呈正相关（图4F-H）。此外，蛋白尿和血清肌酐水平与NLRP3表达呈正相关（图4I，J）。然而，肾小球滤过率（GFR）与NLRP3水平呈负相关（图4K）。
基于NLRP3表达水平的糖尿病肾病和low BMD亚型之间的GSEA分析
根据NLRP3表达水平的中位数，将DN和Low BMD患者的PBMCs分为两个亚组：低NLRP3组和高NLRP3组。进行基因集富集分析（GSEA）以识别与这两个亚组的基因表达谱相关的标志性通路、基因本体和Reactome通路。结果显示，高NLRP3糖尿病肾病亚组和高NLRP3 Low BMD亚组均富集了KRAS信号通路的激活，而上皮-间质转化和糖酵解通路受到抑制。有趣的是，高NLRP3糖尿病肾病亚组表现出DNA修复通路活性降低，而Low BMD PBMCs中的高NLRP3亚组则显示DNA修复通路活性增加（图5A，B）。
此外，GO生物过程分析显示，高NLRP3糖尿病肾病组在免疫相关过程中富集增加，包括免疫反应的激活、免疫反应信号传导和对细菌的反应（图5C）。相反，高NLRP3 Low BMD亚组在核糖体生物合成、核糖核蛋白复合物生物合成、RNA剪接和翻译方面表现出增强的富集（图5D）。在GO细胞组分方面，高NLRP3糖尿病肾病组显示在特异性颗粒、颗粒膜、膜成分、分泌颗粒膜、质膜外侧面的富集增加（图5E）。然而，高NLRP3 Low BMD亚组在核糖体组分中表现出富集，包括核糖体亚基、大核糖体亚基、核糖体和剪接体复合物、胞质核糖体（图5F）。在GO分子功能方面，高NLRP3糖尿病肾病组显示在抗原结合、G蛋白偶联受体活性、免疫受体活性、脂蛋白颗粒受体活性和MHC蛋白复合物结合方面的富集增加（图5G）。相反，高NLRP3 Low BMD亚组表现出更高水平的作用于核酸的催化活性、作用于RNA的催化活性、mRNA结合、核糖核蛋白复合物结合和核糖体的结构组成（图5H）。
此外，基于Reactome的通路分析揭示了高NLRP3糖尿病肾病组在A类1视紫红质样受体、GPCR配体结合、淋巴样和非淋巴样细胞之间的免疫调节相互作用、GPCR信号传导和白细胞介素信号传导方面存在显著差异（图5I），相反，高NLRP3 Low BMD亚组表现出有缺陷的CFTR（导致囊性纤维化）水平升高，以及前mRNA加工、Slit-Robo信号调节、呼吸电子传递和翻译等过程上调（图5J）。
DN亚型间DEGs的识别、功能富集分析和免疫细胞浸润
为了研究DN患者内高和低NLRP3组的免疫浸润景观，使用xCell数据库分析免疫细胞浸润。结果显示，高NLRP3组中MSCs、CD4+记忆T细胞（CD4+ Tem）和CD8+ T细胞的比例显著更高，相反，NK细胞和调节性T细胞（Tregs）在该组中的比例较低（图6A）。进一步分析显示，CD4+ Tem浸润与NLRP3表达水平之间存在显著正相关（图6B）。为了阐明低和高NLRP3表达的DN亚组之间的功能差异，我们进行了差异基因表达（DEG）分析。该分析产生了588个差异表达基因，包括362个上调和226个下调基因（|Log2FC| > 1.20, P值 < 0.05），前12个DEGs在火山图中表示（图6C）。随后，为了深入探究潜在的分子过程和功能，采用了GO和KEGG富集分析。GO分析揭示了高NLRP3组中多种生物过程的富集，包括T细胞活化调控、白细胞细胞间粘附调控、T细胞分化、细胞间粘附调控、白细胞介素-2（interleukin-2）产生、白细胞介素-2产生调控、白细胞细胞间粘附、炎症反应调控、淋巴细胞分化和白细胞介素-2产生正调控通路（图6D）。此外，KEGG通路富集分析显示与细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和核因子κB（NF-κB）信号通路相关，如图6E所示。
NLRP3表达相关基因的基因集变异分析（GSVA）
为了研究与DN亚组中NLRP3表达水平相关的潜在基因集变异，我们将基因表达矩阵转换为基因集表达矩阵。这种方法能够评估样本间的通路富集。我们的研究结果揭示了NLRP3表达与通过NF-κB的TNFα信号传导、炎症反应以及IL-6/JAK/STAT3信号通路富集呈正相关（图8A-C）。相反，糖酵解通路与NLRP3水平呈负相关（图8D）。
通过scRNA-seq数据和PBMCs样本验证DN患者PBMCs中单核/巨噬细胞簇的NLRP3表达
在本研究中，为了进一步验证NLRP3在DN患者PBMCs中的表达，我们对DN患者PBMCs的单细胞数据（GSE233315）进行了重新分析。首先，使用Seurat包处理GSE233315原始数据以过滤PBMCs，得到包含34509个基因和20551个细胞的数据集用于后续分析（图7A），PBMCs对象根据特定标准进行子集划分：如果细胞表达200至2500个基因且线粒体基因表达百分比低于5%，则保留细胞，结果包含34509个基因和1,925个细胞，如图7B所示。随后，使用UMAP进行降维，我们观察到DN和NC（阴性对照）细胞在二维空间中的聚类模式。虽然两组都被聚成九个不同的簇，表明没有明显的组级分离，但我们发现不同簇细胞之间的基因表达谱存在显著差异（图7C）。这些结果表明DN和NC细胞之间的基因表达存在一定程度的一致性。
为了识别九个不同簇中的细胞类型，我们参考了PBMC3K数据集的标记基因（IL7R, CCR7, CD3D, S100A4, CD14, CD163, CD8A, FCGR3A, MS4A7, GNLY, NKG7, FCER1A, CST3, PPBP, 和 MS4A1），并在我们的PBMCs聚类中识别出初始CD4+ T细胞、记忆CD4+ T细胞、巨噬细胞、CD14+单核细胞、CD8 T细胞、自然杀伤细胞、血小板、B细胞和未知簇（图7D），DN组和NC组的簇的UMAP图如图7E所示。接下来，检查了DN组和NC组中的NLRP3表达。结果显示DN组中NLRP3显著上调（图7F，J）。更具体地说，NLRP3表达水平在九个簇中表现出变异性（图7I），在巨噬细胞簇中观察到特别高的水平（图7I）。NLRP3与CD14之间以及NLRP3与CD163之间的基因表达相关性如图7G，H所示。为了研究PBMCs中NLRP3炎症小体的表达，招募了12名经活检证实的糖尿病肾病患者，并分为两个匹配的亚组：6名患有骨质疏松（T值 ≤ -2.5）和6名骨密度保留（T值 ≥ -1.0）。详细的临床特征和DEXA衍生的骨密度指标系统记录在表1中。蛋白质印迹法显示，患有骨质疏松并发症的糖尿病肾病患者在PBMCs中的NLRP3炎症小体表达水平显著高于无骨质疏松的糖尿病肾病患者（图7K，L）。这些结果表明PBMCs中NLRP3的高表达可能是DN患者骨丢失的潜在风险因素。
讨论
最近的调查表明，糖尿病患者中DN和low BMD共存的患病率在10%到70%之间。这种共病显著增加了骨折风险。DNOP的病理生理学涉及多个相互关联的机制：DN中的胰腺功能障碍导致胰岛素缺乏和葡萄糖代谢紊乱，从而损害钙/磷稳态并导致low BMD。此外，患者经常表现出明显的维生素D缺乏，这加剧了胰岛素抵抗，并与慢性肾脏病一起促进电解质失衡、代谢性酸中毒和骨矿物质代谢失调，进一步损害骨矿化。慢性炎症和细胞因子升高在两种疾病中也起着关键作用。最终，破骨细胞介导的骨吸收超过成骨细胞介导的骨形成的不平衡是进行性骨丢失的基础。
通过整合对患者PBMCs的WGCNA和差异基因表达分析，我们识别出DN和low BMD之间共享的十个基因（KLK3, ARL4C, NLRP3, BMI1, AGER, EGR3, OXSR1, CYHR1, RGS19, TUBGCP2）。多算法机器学习将NLRP3确定为一个关键的高表达基因。来自Nephroseq的独立数据证实了其在DN患者骨髓和脊髓中的异常高表达，并揭示了其与肾功能呈负相关。进一步的GSEA和GSVA分析一致表明，高NLRP3表达与上皮-间质转化和糖酵解通路受抑制相关。
此外，对DN患者PBMCs的分析显示，高NLRP3表达与活化的CD4+记忆T细胞、增强的破骨细胞分化和促炎通路（TNF-α, IL6/JAK/STAT3）相关。单细胞RNA测序将高NLRP3表达定位到巨噬细胞簇。由于巨噬细胞是破骨细胞的前体，这表明了一种机制，即NLRP3炎症小体组装（通过NEK7/NACHT相互作用和ASC介导的caspase-1活化）驱动IL-1β/IL-18分泌，可能将PBMCs炎症与DN患者的low BMD联系起来。我们必须承认我们相对较小的临床队列（n=12）进行Western blot验证所带来的局限性。有限的样本量可能会影响结果的稳定性和普适性。因此，需要在更大的、多中心的独立队列中进行进一步验证以确认结果的可靠性。
大量研究证实NLRP3炎症小体是骨代谢的关键调节因子。在OVX小鼠中，NLRP3上调通过降低RUNX2和OCN表达以及抑制SIRT1以促进脂肪生成而非成骨谱系定向来抑制成骨分化。相反，在高糖条件下体外，NLRP3活化表现出ROS/MAPKs/NF-κB依赖性，其中NF-κB进一步放大NLRP3
