《Gut Microbes》：Blautia coccoides-derived metabolite trimethylamine-N-oxide exacerbates Alzheimer's disease progression via targeting HIF1α signaling
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本研究揭示了肠道共生菌Blautia coccoides在阿尔茨海默病（AD）患者中丰度显著升高，其关键代谢产物氧化三甲胺（TMAO）可通过直接结合缺氧诱导因子1α（HIF1α）并抑制其信号通路，进而促进氧化应激和Tau蛋白磷酸化，最终加剧AD病理进展。该发现为基于肠道菌群/代谢物的AD干预策略提供了新靶点。
B. coccoides丰度在AD患者中升高并加剧P301S小鼠的病理发生
研究首先检测了阿尔茨海默病（AD）患者和年龄匹配的健康对照（HC）的粪便Blautia coccoides丰度和血清磷酸化Tau181（p-Tau181）水平。结果显示，AD患者粪便中的B. coccoides丰度显著高于HC。同时，AD患者的血清p-Tau181水平也显著升高。受试者工作特征（ROC）曲线分析表明，B. coccoides丰度对AD患者的p-Tau181水平具有预测价值，曲线下面积（AUC）为0.786。这些发现提示B. coccoides可能参与AD的进程。
为了进一步探究B. coccoides是否影响AD进展，研究使用P301S转基因小鼠模型，每日灌胃B. coccoides（1 × 109CFU/mL）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）连续21天。定量PCR（qPCR）结果证实B. coccoides能够在P301S小鼠肠道内定植。行为学实验表明，与PBS处理的P301S小鼠相比，B. coccoides处理显著加重了小鼠的认知功能障碍。在新物体识别测试（ORT）中，B. coccoides处理组小鼠的辨别指数显著降低。在巴恩斯迷宫测试中，B. coccoides处理组小鼠在第3天和第4天的逃避潜伏期显著延长，并且在测试阶段停留在目标象限的时间显著减少。这些结果表明B. coccoides处理显著损害了P301S小鼠的空间学习和记忆能力。
认知障碍通常伴随AD的病理变化，其特征是Tau蛋白的过度磷酸化。AT8免疫组化染色结果显示，B. coccoides处理显著增加了P301S小鼠大脑皮层中磷酸化Tau蛋白的水平。TUNEL染色结果显示，B. coccoides处理显著增加了P301S小鼠大脑皮层中的TUNEL阳性细胞数量。这些发现表明B. coccoides能够加剧P301S小鼠的病理损伤。
B. coccoides来源的TMAO是AD发病机制中的潜在因素
为了探究B. coccoides影响AD的机制，研究分析了其对肠道菌群整体结构的影响。16S rRNA测序分析显示，B. coccoides处理组与P301S对照组之间在α多样性指数（如Shannon指数和Simpson指数）上没有显著差异。主坐标分析（PCoA）结果也表明两组间菌群结构无显著差异。这说明B. coccoides处理并未改变P301S小鼠肠道菌群的整体结构。
研究焦点转向肠道细菌产生或诱导的代谢物，它们可能通过肠脑轴调节大脑功能。为了识别关键代谢物，研究对B. coccoides进行了功能基因分析和体内外代谢组学分析。对B. coccoides功能基因的KEGG通路富集分析显示，其基因在代谢通路和阿尔茨海默病通路中显著富集。对小鼠粪便的非靶向代谢组学分析发现了差异代谢物，其中氧化三甲胺（TMAO）在变量重要性投影（VIP）分析中被识别为重要差异代谢物。相关性分析显示，TMAO等5种VIP差异代谢物与g_Blautia丰度呈显著正相关。对功能基因片段的分析发现，B. coccoides含有胆碱TMA裂解酶（CutC），这是TMA代谢中的关键酶。线性回归分析显示，B. coccoides丰度与粪便TMAO水平呈显著正相关，提示TMAO可能是B. coccoides的关键代谢物。
为了进一步证实B. coccoides能够产生TMA/TMAO，研究在体外将B. coccoides与胆碱共培养，并用其发酵上清液处理能够表达黄素单加氧酶3（FMO3，可将TMA转化为TMAO）的HCC-LM3细胞。结果显示，与对照组相比，B. coccoides+ 胆碱组发酵上清液中的TMA水平显著升高，LM3细胞培养基中的TMAO水平也显著高于对照组，且高于其他物种（如B. producta）+ 胆碱组。这些发现表明B. coccoides能够直接产生TMAO。
此外，研究评估了B. coccoides对肠道屏障的影响。Western blot和免疫组化结果显示，B. coccoides处理显著降低了P301S小鼠肠道中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的水平，表明B. coccoides可能加剧肠道屏障损伤和肠道通透性增加，从而允许TMAO进入体循环。
研究进一步假设B. coccoides丰度可能与血清和脑内TMAO水平相关。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析发现，与P301S对照组相比，B. coccoides处理组小鼠的血清和脑组织中的TMAO水平均显著升高。线性回归分析显示，在P301S小鼠中，B. coccoides丰度与脑内TMAO水平呈显著正相关。
血清TMAO水平升高与AD患者痴呆严重程度相关且TMAO在体外促进氧化应激
升高水平的TMAO与多种人类疾病相关，包括AD。研究采用双样本孟德尔随机化（MR）分析，揭示了血浆TMAO水平与AD痴呆严重程度之间存在正向的因果关系。这些临床数据表明AD患者TMAO水平升高，并提示TMAO在AD发病机制中的潜在作用。
在体外实验中，研究使用转染了MAPT P301L突变体的Neuro-2a（P301L-N2a）和HEK-293T（P301L-293T）细胞作为模型细胞。用不同浓度TMAO处理细胞后，细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞活力，发现20 μM TMAO在低于半数抑制浓度（IC50）的情况下已能产生显著的生物学效应，因此后续细胞实验选用此浓度。Western blot和免疫荧光分析显示，TMAO处理显著增加了P301L-N2a和P301L-293T细胞中Tau蛋白在T181和S396位点的磷酸化水平（p-Tau181和p-Tau396）。这表明TMAO能够在体外促进AD相关的Tau蛋白磷酸化。
TMAO已被证实与促进氧化应激有关，而氧化应激会进一步加剧由活性氧（ROS）和脂质过氧化驱动的Tau磷酸化。流式细胞术检测ROS水平的结果显示，TMAO处理显著增加了P301L-N2a和P301L-293T细胞内的ROS水平。这些结果提示TMAO促进了ROS的产生，从而加剧了AD中的氧化应激。
TMAO在AD中调控的关键信号通路分析
为了阐明TMAO处理后促进氧化应激的机制，研究进行了药物靶点分析和RNA测序（RNA-seq），以识别与氧化应激相关的关键信号通路。通过SuperPred数据库预测TMAO的潜在作用靶点，并与GeneCards数据库中AD相关基因取交集，获得41个重叠基因。对重叠基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析和CytoHubba插件最大团中心性（MCC）算法筛选，确定了包括缺氧诱导因子1α（HIF1α）在内的前10个核心靶点。对这些重叠基因的KEGG通路富集分析显示，HIF1信号通路和阿尔茨海默病通路显著富集。
同时，对TMAO处理与未处理的Neuro-2a细胞进行RNA-seq分析，筛选差异表达基因（DEGs）。KEGG通路富集分析再次显示，HIF1信号通路和阿尔茨海默病通路在DEGs中显著富集，表明HIF1通路可能在TMAO加剧AD的过程中扮演重要角色。
因此，研究在体外用TMAO处理P301L-N2a细胞18小时后，再置于低氧（1% O2）条件下培养6小时以稳定HIF1α蛋白表达。Western blot分析显示，与对照组相比，TMAO处理组细胞中HIF1α及其下游抗氧化应激相关蛋白血红素加氧酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的蛋白表达水平均显著降低。同样，在B. coccoides处理的P301S小鼠脑组织中，HIF1α、HO-1、SOD2和GPX4的蛋白水平也显著下降。这些结果提示TMAO抑制了HIF1α信号通路。
为了进一步确认TMAO通过HIF1α介导的HIF1信号通路促进Tau磷酸化，研究在P301L-293T细胞中过表达HIF1α（OE）并同时用TMAO处理。低氧暴露后，Western blot结果显示，在TMAO + OE组中，HIF1α、HO-1、SOD2和GPX4的蛋白水平相较于单独TMAO处理组得到显著恢复。同时，Tau蛋白在T181和S396位点的磷酸化水平在TMAO + OE组中也显著降低。
此外，体内实验证实，直接给P301S小鼠灌胃TMAO 21天，可显著加重其认知功能障碍，表现为ORT辨别指数降低，巴恩斯迷宫逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短。免疫组化和Western blot结果一致显示，TMAO处理增加了小鼠脑皮层TUNEL阳性细胞数量和Tau蛋白磷酸化水平，并降低了HIF1α、HO-1、SOD2和GPX4的蛋白表达，表明氧化应激增强和氧化还原稳态改变。
TMAO通过HIF1α相互作用促进Tau磷酸化
为了探究TMAO如何影响HIF1通路，研究进一步考察了其与核心靶点HIF1α的相互作用。分子对接模拟结果显示，TMAO能够与HIF1α蛋白的第235-238位点结合。因此，研究构建了野生型HIF1α（HIF1α-WT）和235-238位点缺失突变型HIF1α（HIF1α-Mut）过表达质粒。
在P301L-293T细胞中，分别转染HIF1α-WT或HIF1α-Mut质粒，并给予TMAO处理。流式细胞术检测发现，在HIF1α-WT背景下，TMAO处理显著增加了ROS水平；然而，在HIF1α-Mut背景下，TMAO处理引起的ROS升高效应被挽救。Western blot分析显示，在HIF1α-WT组中，TMAO处理显著降低了HIF1α、HO-1、SOD2和GPX4的蛋白水平，并增加了p-Tau181和p-Tau396的水平；而在HIF1α-Mut组中，TMAO对这些蛋白水平的抑制作用显著减弱，p-Tau181和p-Tau396的水平也相应降低。免疫荧光结果也验证了p-Tau396水平的变化。这些数据证实了TMAO与HIF1α之间存在相互作用，并表明TMAO通过抑制HIF1α信号通路，机制性地促进了AD中的氧化应激和Tau病理。
讨论
本研究观察到AD患者体内B. coccoides丰度显著升高，且与血清p-Tau水平正相关。动物实验证实补充B. coccoides会加剧AD模型动物的认知障碍和Tau磷酸化。通过体内外实验，研究将TMAO确定为B. coccoides的关键代谢物，并证明TMAO可加剧Tau磷酸化。机制上，TMAO通过直接结合HIF1α，抑制HIF1α信号通路，进而促进氧化应激，最终加重AD病理。该研究为AD的干预提供了新的潜在靶点。
结论
综上所述，本研究证实了Blautia coccoides来源的TMAO通过结合HIF1α并抑制其信号通路，促进氧化应激，最终导致Tau蛋白磷酸化加剧，从而推动阿尔茨海默病的进展。这一发现揭示了肠道菌群代谢物在AD发病中的新机制，为开发基于微生物/代谢物的AD干预策略提供了重要理论依据。
