《Gut Microbes》：O?Island 28 encodes a type I secretion and RTX adhesion system regulated by RstA and required for early EHEC O157:H7 adherence
编辑推荐：
本研究发现，在肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7中，O-岛28（OI-28）编码一个完整的I型分泌系统（T1SS）和两个RTX家族粘附素。该研究揭示了响应调节蛋白RstA直接激活OI-28的表达，且胞外Ca2+通过RstA依赖的方式增强OI-28介导的细菌粘附。动物实验表明，OI-28对于EHEC在肠道早期的有效定植至关重要，且这一机制在多种致病性E. coli菌株中保守。这项工作阐明了一条独立于III型分泌系统（T3SS）的粘附通路，为抗毒力治疗提供了新靶点。
Abstract
肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）是一种重要的食源性病原体，可导致严重腹泻、出血性结肠炎（Hemorrhagic Colitis, HC）和溶血性尿毒综合征（Hemolytic Uremic Syndrome, HUS）。O-岛（O-Islands）是EHEC O157:H7基因组中特有的区域，其中许多与毒力相关的致病岛（Pathogenicity Islands, PAIs）重叠。O-岛28（OI-28）是一个保守的基因组岛，预测编码一个完整的I型分泌系统（Type I Secretion System, T1SS）和两个RTX家族蛋白，但其在致病过程中的作用尚不清楚。本研究显示，缺失OI-28会显著降低EHEC O157:H7对上皮细胞的粘附能力及小鼠肠道定植能力，但不影响体外生长。机制上，OI-28的表达受响应调节蛋白RstA的直接正向调控，RstA直接结合于OI-28的调控区域。与RTX粘附素的钙依赖性折叠特性一致，胞外Ca2+以RstA依赖的方式增强OI-28的表达和T1SS依赖的粘附，并且饮食中钙的耗竭会降低体内早期定植。比较基因组学进一步证明OI-28为多种致病性E. coli菌株的定植所必需。这些发现表明，OI-28是一个由RstA激活、钙响应的T1SS分泌系统，在致病性E. coli菌株中保守，并对有效的上皮粘附和早期肠道定植至关重要。
Introduction
EHEC O157:H7的致病性涉及多种关键毒力因子，包括志贺毒素（Shiga toxins, Stx）的产生和肠上皮细胞上 attaching and effacing (A/E) 损伤的形成。基因座肠细胞消除（Locus of Enterocyte Effacement, LEE）编码的III型分泌系统（Type III Secretion System, T3SS）介导了A/E损伤的形成。此外，其他粘附素、外膜蛋白和分泌毒素也进一步促进感染过程中的定植和持久存在。
T1SS是革兰氏阴性菌中已知的一步式分泌途径，由内膜ATP结合 cassette（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白、膜融合蛋白（Membrane Fusion Protein, MFP）和外膜蛋白（Outer Membrane Protein, OMP）组成，形成一个跨越细菌包膜的连续通道。T1SS负责输出多种效应蛋白，包括重复毒素（Repeats-in-Toxin, RTX）蛋白。RTX毒素的特征是富含甘氨酸和天冬氨酸的重复基序，可协调Ca2+结合。在Ca2+有限的胞质环境中，RTX蛋白保持非折叠状态；但当其通过T1SS分泌到富含Ca2+的胞外环境时，会迅速折叠成稳定构象，发挥其细胞毒性或粘附功能。
在EHEC O157:H7中，一个先前未表征的基因组区域OI-28预测编码一个完整的T1SS和两个RTX毒素，但其在致病中的作用仍不明确。细菌通过双组分系统（Two-Component System, TCS）感知环境变化并调节毒力基因表达。RstAB TCS在EHEC O157:H7中调节毒力、酸耐受性和生物膜形成方面起主要作用。本研究旨在阐明OI-28在EHEC O157:H7致病机制中的功能及其调控方式。
Results
An evolutionarily conserved OI?28 encodes a predicted T1SS and RTX toxin
对2,122个E. coli基因组的分析显示，OI-28在EHEC O157:H7、O145:H28和EPEC O55:H7中高度保守，但在UPEC、其他STEC、ExPEC和EAEC中存在率较低或完全缺失。在EHEC O157:H7菌株EDL933中，OI-28包含一个编码典型T1SS所有必需组件的基因簇：ABC转运蛋白（Z0634/HlyB28）、MFP（Z0635/HlyD28）和OMP（Z0608/TolC28）。亚细胞定位预测支持这些蛋白分别定位于细胞质膜、细胞质膜和外膜。此外，OI-28还包含两个预测编码大型RTX家族蛋白的基因（Z0609/RtxA28和Z0615/RtxB28），其具有典型的RTX结构域和C端免疫球蛋白样（Ig-like）结构域。这些结果表明OI-28编码一个功能性的T1SS/RTX系统。
OI?28 supports early adherence and colonization
构建了OI-28缺失突变株（ΔOI-28）。感染Caco-2细胞3小时后，ΔOI-28菌株的粘附能力比野生型（WT）降低了约3.28倍。荧光肌动蛋白染色（Fluorescent Actin Staining, FAS）检测A/E损伤显示，ΔOI-28菌株诱导的肌动蛋白 pedestal 数量显著减少。这种粘附和 pedestal 形成缺陷在感染早期（3小时和6小时）明显，但在9小时后差异消失。qRT-PCR分析表明，ΔOI-28并不影响T3SS主要基因的表达。小鼠体内定植实验显示，ΔOI-28菌株的肠道定植能力显著降低，但小鼠体重变化和死亡率与WT无显著差异。ΔOI-28在LB和DMEM培养基中的生长曲线与WT无差异。这些结果证明OI-28影响EHEC O157:H7的早期粘附、actin pedestal形成和定植，但不影响细菌生长和疾病严重程度。
The T1SS and RTX proteins encoded by OI?28 are required for adhesion and colonization.
构建了OI-28内五个基因的单基因缺失突变株（ΔtolC28, ΔrtxA28, ΔrtxB28, ΔhlyB28, ΔhlyD28）。这些突变株的生长不受影响。粘附实验和FAS分析表明，所有单基因突变株的粘附能力和诱导pedestal形成的能力均显著低于WT。小鼠定植实验也显示，所有突变株的定植能力均下降。将hlyB28, hlyD28, tolC28基因回补至相应突变株中，可恢复其粘附和定植能力至WT水平。由于rtxA28和rtxB28基因过大，无法进行全长回补，因此构建了仅包含两个Ig-like结构域的截短版本进行回补，部分恢复了粘附和定植能力。这表明OI-28中的所有五个基因对于细菌粘附和体内定植都是必需的，其中RTX蛋白RtxA28和RtxB28作为粘附素发挥作用。
OI-28 in EHEC O157:H7 is directly regulated by RstA
qRT-PCR分析显示，与WT相比，ΔrstA突变株中OI-28编码的T1SS组件（hlyB28, hlyD28, tolC28）和RTX毒素基因（rtxA28, rtxB28）的表达量显著下降（3.25-4.85倍），回补rstA后可恢复表达。将tolC28的调控区和启动子区克隆至lacZ报告质粒中，LacZ融合实验表明，ΔrstA菌株中报告基因活性降低。生物信息学分析在tolC28上游预测到一个σ70型启动子和一个RstA结合盒（RstA box）。染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）证实RstA在体内结合于tolC28的调控区。电泳迁移率变动分析（EMSA）进一步证实纯化的RstA蛋白在体外可直接结合含有RstA box的tolC28调控区DNA片段，而不结合缺失该位点的片段。这些数据表明RstA通过直接结合其调控区来激活OI-28的转录。
Extracellular Ca2+promotes OI?28 expression and adherence via RstA.
鉴于RTX粘附素依赖胞外Ca2+进行正确折叠，研究了Ca2+信号的作用。在DMEM（含~2mM Ca2+）和添加2mM EGTA（螯合游离Ca2+）的DMEM中培养细菌。qRT-PCR和tolC28-lacZ报告基因活性分析显示，在WT菌株中，DMEM条件下的OI-28基因表达和启动子活性显著高于EGTA条件。然而，在ΔrstA菌株中，Ca2+浓度的变化不引起OI-28表达或启动子活性的改变。粘附实验表明，EGTA处理显著降低了WT菌株的粘附，但对ΔrstA菌株的粘附无影响。小鼠实验中，低钙饮食显著降低了WT菌株的早期定植能力，而对ΔrstA菌株的定植无相应影响。这些结果支持了一个模型：胞外Ca2+通过RstAB系统被感知，进而上调OI-28表达，协调T1SS组装和RTX粘附素的Ca2+依赖性折叠，从而促进早期粘附。
The T1SS is widespread in different pathogenic E. colistrains
在EHEC O157:H7 G1329、G2534和O145:H28 G1345菌株中构建了OI-28缺失突变株。小鼠定植实验表明，所有这些突变株在结肠中的定植能力均显著低于其相应的WT菌株。此外，在这些菌株中，正常钙饮食条件下的定植能力显著高于低钙饮食条件。这表明OI-28介导的定植机制在多种致病性E. coli谱系中是一种保守的、普遍存在的机制，且膳食钙广泛地促进EHEC的体内定植。
Discussion
本研究鉴定出OI-28是EHEC O157:H7中一个保守的致病岛，其编码的T1SS和RTX毒素对于细菌的早期粘附和肠道定植至关重要。研究发现RstA通过直接结合OI-28的调控区并感知胞外Ca2+来激活其转录。OI-28在多种致病性E. coli菌株中保守存在，并赋予广泛的定植优势，表明T1SS/RTX系统是一条独立于T3SS的、普遍的毒力通路，是一个有前景的抗毒力靶点。这些发现为理解EHEC O157:H7的致病机制提供了新见解，并为开发针对性的治疗策略奠定了基础。未来的工作将阐明T3SS和T1SS在感染不同阶段的相互作用。
Materials and methods
详细描述了本研究中使用的菌株、质粒、基因组分析方法、结构域预测、细胞系、动物模型、突变体构建、生长曲线、细胞粘附实验、FAS实验、小鼠感染实验、RNA提取与qRT-PCR、LacZ融合实验、ChIP-qPCR和EMSA等实验方法。所有实验均遵循相关伦理指南。
