富集环境通过多巴胺-H2S轴介导的双重线粒体自噬激活改善脑缺血再灌注损伤

《Antioxidants》：Enriched Environment Ameliorates Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury via Dopamine–H2S Axis-Mediated Dual Mitophagy Activation

本研究首次揭示富集环境（EE）通过激活多巴胺信号通路，上调内源性硫化氢（H2S）水平，进而协同激活经典（PINK1/parkin）与非经典（HIF-1α/BNIP3L）两条线粒体自噬通路，从而改善脑缺血再灌注损伤（CIRI）后的线粒体功能与氧化应激状态，最终促进神经功能恢复。该研究为脑卒中康复的非药物干预提供了新的分子靶点与理论依据。

　　

文章内容归纳总结

1. 引言

脑卒中是一种急性脑血管疾病，其中缺血性脑卒中约占所有卒中病例的65.3%。当前临床管理主要侧重于通过静脉溶栓、机械取栓和抗血栓治疗来恢复脑血流灌注。然而，成功的血管再通常常伴随着脑缺血再灌注损伤（CIRI），而氧化应激是其中的关键病理机制。

在缺血期间，氧和葡萄糖的剥夺会破坏神经元代谢，导致活性氧（ROS）的过度积累。再灌注时，氧气的突然重新引入会引发自由基链式反应，导致ROS水平瞬时激增。这种ROS超载会诱导一系列细胞毒性事件，包括脂质过氧化、蛋白质修饰和DNA损伤，从而进一步加剧氧化应激。

线粒体是氧化应激的核心靶点。作为细胞内ROS的主要来源，线粒体功能障碍在病理条件下会加剧ROS的过量产生。为了维持细胞稳态，线粒体自噬（一种选择性清除受损线粒体的自噬形式）发挥着重要的神经保护作用。然而，过量的ROS反过来又会损害自噬过程，导致线粒体清除缺陷。这形成了一个ROS积累和线粒体自噬功能障碍的恶性循环，进一步放大了CIRI中的神经元损伤。

富集环境（EE）是一种非药物行为干预，通过提供多感官刺激、社会互动和自主身体活动来增强神经可塑性和认知功能。研究表明，EE可能通过上调脑源性神经营养因子（BDNF）、血管内皮生长因子（VEGF）和神经生长因子（NGF）等神经营养因子来发挥其有益作用，从而促进神经发生、血管生成和突触可塑性。此外，越来越多的证据表明，EE可能通过调节细胞死亡途径（包括凋亡、焦亡和铁死亡）以及改善脑血流来赋予神经保护作用。

硫化氢（H₂S）是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后被认识的第三种内源性气体信号分子，近年来因其在心血管和神经系统中的抗凋亡和抗氧化作用而受到关注。H₂S能够直接清除ROS并减轻氧化应激。此外，它已被证明可以通过调节线粒体膜电位、影响电子传递链组分、调节能量代谢相关酶以及促进线粒体融合来稳定线粒体功能。

值得注意的是，多巴胺是大脑中一种关键的神经递质和代谢调节剂，已成为脑缺血损伤背景下的潜在治疗靶点。先前的研究表明，多巴胺可能间接调节硫化氢（H₂S）产生酶（如胱硫醚-β-合酶CBS和胱硫醚-γ-裂解酶CSE）的表达，从而调节内源性H₂S的产生。

基于此，本研究提出一个新颖的假说：EE可能通过调节多巴胺-H₂S信号轴，进而影响线粒体自噬和能量代谢，从而发挥神经保护作用，改善缺血再灌注损伤。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

本研究使用性成熟的雄性C57BL/6小鼠（8-12周龄，体重24-28克）。所有实验方案均经过复旦大学实验动物伦理审查委员会审查并批准。

2.2. 动物模型建立

采用大脑中动脉闭塞（MCAO）模型模拟脑缺血再灌注损伤。小鼠麻醉后，通过颈动脉插入带有硅胶头的尼龙单丝线，阻断大脑中动脉起始部血流1小时，然后撤出单丝线恢复血流，建立再灌注模型。假手术组除不插入单丝线外，其余操作相同。

2.3. 富集环境干预

成功建立MCAO模型的小鼠被随机分为MCAO组、EE组、AOAA组和YC-1组。除MCAO组外，其余组别在术后第二天进行神经功能评分后，被置于富集环境中。富集环境为小鼠提供了更大的活动空间（80 cm × 60 cm × 40 cm），并容纳约12只同种小鼠。环境内配置了各种类型的垫料、不同气味的香料以及新颖的玩具设施（如跷跷板、转盘、小球、隧道、楼梯和庇护所）。为了保持新奇感，每天在固定时间更换各种设施的类型和位置。对照组则饲养在标准笼具中，空间有限，每笼仅容纳4-6只小鼠。

2.4. 细胞培养与氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型

使用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系。为了建立体外缺血缺氧模型，将细胞培养在无葡萄糖和无胎牛血清的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，置于缺氧培养箱内（95% N₂和5% CO₂，氧浓度低于0.2%）孵育4小时，以诱导体外缺血损伤。OGD处理后，将细胞放回常氧条件下的完全培养基中，复氧24小时。

2.5. 药物干预

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  NaHS： 作为外源性H₂S供体，在OGD/R处理前30分钟以200 μmol/L的终浓度给药。
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  Mdivi-1： 作为线粒体自噬抑制剂，在OGD/R处理前30分钟以25 μM的终浓度给药。
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  AOAA： 作为H₂S合成酶（CBS和CSE）的抑制剂，在手术前两周和一周以20 mg/kg的剂量给药，术后继续每日给药以维持酶抑制。
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  YC-1： 作为缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）的抑制剂，在脑缺血模型诱导前12小时通过尾静脉给药（2 mg/kg），术后每日尾静脉注射以维持低HIF-1α表达。

2.6. 评估指标

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  神经功能评估： 采用改良神经功能缺损评分（mNSS）评估感觉运动功能；使用CatWalk XT系统进行步态分析；通过旷场实验评估自主活动和探索行为；通过转棒实验评估运动协调能力。
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  脑梗死体积评估： 采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法。
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  组织学与分子生物学分析： 包括尼氏染色、TUNEL染色、透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构、免疫荧光染色、Western blotting、免疫共沉淀（Co-IP）等。
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  氧化应激指标检测： 检测丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽（GSH）水平。
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  线粒体功能检测： 使用JC-1探针检测线粒体膜电位，使用MitoTracker探针检测线粒体形态和分布，检测ATP水平。
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  H₂S含量检测： 使用H₂S特异性荧光探针HSip-1和HSip-1 DA进行定量。
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  转录组测序： 对小鼠脑组织进行高通量RNA测序，进行基因集富集分析（GSEA）和差异表达基因分析。

3. 结果

3.1. EE通过减轻神经元凋亡和减少梗死体积发挥神经保护作用

TTC染色结果显示，与假手术组相比，MCAO组脑梗死体积显著增加。EE干预一周后，梗死体积显著减小。神经功能缺损评分（mNSS）显示，EE治疗组小鼠在术后一周表现出显著的功能恢复。尼氏染色显示，MCAO组神经元丢失严重，细胞排列稀疏，尼氏体减少，而EE治疗显著恢复了尼氏体密度并改善了神经元形态。Western blotting结果显示，与MCAO组相比，EE干预显著抑制了Cleaved Caspase3/Caspase3比值和Bax的表达，并显著提高了抗凋亡因子Bcl-2的表达。TUNEL染色结果进一步证实，EE干预显著减轻了神经元凋亡。

3.2. EE对脑缺血再灌注损伤后的线粒体动力学和线粒体自噬具有显著的调节作用

Western blot结果显示，脑缺血再灌注损伤后，线粒体分裂-融合平衡被破坏，MCAO组p-Drp1/Drp1比值显著升高，表明存在过度的线粒体分裂。同时，线粒体融合调节因子OPA1、Mfn2和Mfn1的表达显著下调。EE治疗部分逆转了p-Drp1/Drp1比值的病理性升高，并恢复了缺血脑中Mfn1、Mfn2和OPA1的表达水平。透射电子显微镜（TEM）分析显示，假手术组线粒体具有清晰的嵴结构和均匀的基质密度。而MCAO组线粒体表现出典型的病理改变，包括球形肿胀、嵴断裂、膜完整性不连续，以及典型的线粒体分裂和线粒体自噬特征。EE干预减轻了线粒体损伤，并提高了自噬清除效率。Western blot分析显示，EE显著增加了线粒体自噬标志物parkin的表达以及LC3B-II/LC3B-I比值。重要的是，EE治疗组小鼠梗死周围皮层中p62的积累显著减少，表明自噬流未受损，自噬体被有效降解。

3.3. EE调节内源性H₂S产生，减轻氧化应激，并在CIRI后维持线粒体功能

蛋白定量结果显示，MCAO组关键的内源性H₂S产生酶（CBS和CSE）以及抗氧化应激蛋白NAMPT和锰超氧化物歧化酶（MnSOD）的表达显著降低。这些改变在EE干预一周后得到显著逆转。HSip-1荧光探针检测显示，MCAO组梗死周围组织和血清中的H₂S水平降低，而EE改善了这一状况。将不同组小鼠的血清加入SH-SY5Y细胞培养基中，结果显示，MCAO组细胞内ROS水平显著升高，而EE减轻了这种效应。MitoTracker和JC-1检测显示，MCAO组细胞MitoTracker荧光强度减弱，线粒体膜电位显著崩溃，而EE显著恢复了线粒体膜电位。

3.4. H₂S通过改善线粒体自噬和线粒体功能来改善缺血缺氧神经元

在OGD/R处理的神经元中，H₂S水平显著降低，而NaHS共培养显著增加了HSip-1 DA荧光强度。JC-1检测显示，OGD/R后线粒体膜电位去极化，H₂S补充恢复了膜电位，而线粒体自噬抑制剂Mdivi-1加剧了去极化。流式细胞术分析显示，OGD/R诱导了显著的神经元死亡，H₂S补充显著挽救了神经元免于OGD/R诱导的凋亡，而抑制线粒体自噬进一步加剧了神经元功能障碍。Western blot分析显示，H₂S介导了经典（PINK1/parkin）和非经典（HIF-1α/BNIP3L）线粒体自噬通路的激活，并增强了自噬流。

3.5. EE通过H₂S调节改善线粒体自噬和线粒体功能

Western blot分析显示，EE显著增强了梗死周围脑组织中的线粒体自噬，这种增强在H₂S合成被抑制后被消除。透射电子显微镜显示，EE减轻了线粒体肿胀，保留了嵴完整性，并增加了线粒体自噬空泡和正常线粒体的数量，这些效应在AOAA处理后均被逆转。免疫荧光证实，EE诱导的LC3B上调在AOAA作用下被抑制。定量H₂S检测验证了EE介导的H₂S恢复以及AOAA的抑制作用。氧化应激标志物定量分析显示，EE显著改善了MCAO小鼠的MDA、总谷胱甘肽和T-AOC水平，而当内源性H₂S合成被抑制时，EE的有益效应显著减弱。

3.6. EE通过H₂S调节激活非经典HIF-1α/BNIP3L/LC3B线粒体自噬通路

使用HIF-1α抑制剂YC-1进行验证。蛋白定量分析结果显示，EE通过HIF-1α/BNIP3L/LC3B通路显著增强了线粒体自噬的激活，这种增强在HIF-1α被抑制后显著减弱。免疫荧光成像证实，EE介导了梗死周围区域HIF-1α和LC3B的上调。YC-1治疗组的结果表明，抑制HIF-1α导致自噬标志物LC3B的表达显著减少。

3.7. EE介导的H₂S调节通过恢复线粒体自噬改善脑缺血后的神经功能

TUNEL/NeuN双标免疫荧光显示，MCAO组梗死周围区域存在广泛的神经元死亡，EE显著挽救了这种死亡，而H₂S或HIF-1α抑制部分减弱了这种神经保护作用。旷场实验显示，与假手术组相比，MCAO组小鼠的总运动距离和中央区域运动距离均显著减少。EE干预显著改善了缺血小鼠的一般运动表现和探索行为，特别是中央区域活动显著增强。当H₂S和HIF-1α含量降低时，EE干预的神经保护作用显著降低。CatWalk步态分析显示，MCAO组小鼠患侧接触面积显著减少，患侧足底压力降低，足部离地（支撑相）时间延长。EE显著改善了脑缺血小鼠的整体运动速度和患侧后肢的摆动速度。然而，这些改善效应被H₂S和HIF-1α抑制剂所逆转。

3.8. EE通过多巴胺调节的钙调蛋白信号增强H₂S生物合成

转录组测序和生物信息学分析显示，EE驱动的多巴胺生物合成过程、多巴胺分泌和多巴胺反应通路上调。免疫共沉淀证实了神经元中钙调蛋白（CaM）与CSE之间存在分子相互作用。基因集富集分析（GSEA）还揭示了EE介导的缺血脑中氧化应激和凋亡的抑制。火山图分析证实了EE诱导的线粒体自噬调节因子（Pink1, Prkn）和H₂S合成酶（Cbs, Cth）的上调，同时Drd1和Calm1的表达也增强。体外实验进一步支持了多巴胺信号在细胞内H₂S产生中的调节作用。

4. 讨论

本研究首次证明，EE通过多巴胺信号促进内源性H₂S的合成。H₂S产生的上调协同激活了经典（PINK1/parkin）和非经典（HIF-1α/BNIP3L）两条线粒体自噬通路，从而改善了脑缺血再灌注损伤后神经元的线粒体功能和氧化应激状态，最终促进了神经功能恢复。这些发现将行为干预与气体信号分子调节相结合，并建立了一个新的神经保护轴，即“EE-多巴胺-H₂S-线粒体自噬”通路。

当前针对CIRI的治疗方法，包括抗氧化剂给药和外源性H₂S供体，受到血脑屏障通透性差、治疗窗口窄和潜在的剂量依赖性毒性的限制。相比之下，EE提供了一种非侵入性、系统性且长期安全的策略，可以自主刺激神经-内分泌-线粒体轴，从而克服传统治疗的局限性。

本研究的新颖之处在于发现EE刺激可以同时激活两条线粒体自噬通路。更重要的是，我们首次证明EE通过上调内源性H₂S来协调这种双重激活，从而恢复氧化还原平衡和线粒体稳态。这一发现填补了目前对EE神经保护中线粒体调节理解的空白。

在机制层面，本研究通过体内外模型证明，EE有力地激活了PINK1/parkin和HIF-1α/BNIP3L线粒体自噬通路。值得注意的是，缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）在脑缺血中的作用仍存在争议。本研究的结果表明，HIF-1α可能通过促进线粒体自噬来促进脑缺血后的神经功能恢复。

适度的线粒体自噬对于及时清除和回收受损线粒体至关重要，进而促进健康线粒体的生物合成。相反，这一过程的破坏会导致许多有害的细胞效应。本研究中，EE通过经典的PINK1/parkin通路显著增强了线粒体自噬。值得注意的是，在EE条件下，HIF-1α/BNIP3L通路也被上调。我们的体内外研究结果支持了EE诱导的内源性H₂S有助于改善线粒体自噬活性的观点。

本研究存在一些局限性。首先，实验模型仅使用了雄性动物。其次，虽然转录组分析揭示了EE显著调节与多巴胺系统相关的基因和生物学通路，并且我们的Co-IP实验和体外DR1激动剂实验初步提示了多巴胺信号与H₂S合成酶CSE之间存在机制联系，但未在体内进行多巴胺或其受体的直接药理学或遗传学操作。因此，所提出的DR1-CSE/H₂S轴仍然是部分推测性的，缺乏确切的因果证据来排除间接调节机制的可能性。第三，尽管在体内外模型中进行了整合验证，但一些关键方面仍未解决，包括H₂S在特定神经元亚群中的时空动态、不同脑区的区域差异以及剂量或时间依赖性效应。

5. 结论

EE通过激活多巴胺信号通路来增强内源性H₂S的生物合成，从而发挥神经保护作用。这改善了缺血神经元中的线粒体自噬和线粒体功能，减轻了氧化应激，抑制了细胞凋亡，并促进了神经功能恢复。