《Italian Journal of Animal Science》：Determining the optimal dose of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles for enhancing growth, antioxidant status, immunity, digestion, and cecal microbiota in fattening rabbits
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本研究首次系统评估了香芹酚壳聚糖纳米粒（CRV-CHNPs）作为饲料添加剂对育肥新西兰白兔的多重效益。通过八周饲养实验发现，400-500 mg/kg的CRV-CHNPs能线性提升生长性能（ADG）、饲料效率（FCR）和胴体品质，显著增强抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性及免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）水平，并优化盲肠微生物群（促进乳酸菌，抑制大肠杆菌等致病菌）。组织学证实其改善肝肾功能，分子对接显示CRV与抗氧化/免疫通路蛋白强结合。该研究为CRV-CHNPs作为替代抗生素的天然饲料添加剂提供了理论依据。
分子对接揭示作用机制
研究通过分子对接分析发现，香芹酚（CRV）与多种关键蛋白具有显著结合亲和力。其中与谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的结合最为稳定，主要通过疏水作用实现。与蛋白酶和脂肪酶的相互作用则同时涉及氢键和疏水接触，表明CRV可能直接调节消化酶活性。然而，与淀粉酶的结合在能量上不利，提示其作用可能存在特异性。这些计算结果从理论上预测了CRV通过调控抗氧化、免疫和消化相关蛋白通路发挥其生物学效应的潜在分子基础。
CRV-CHNPs的制备与表征
研究成功制备了香芹酚壳聚糖纳米粒（CRV-CHNPs）。透射电镜显示其为球形、形态均匀的颗粒，直径在67-146纳米之间。动态光散射测得的流体动力学尺寸为189纳米，多分散指数（PDI）为0.441，表明颗粒大小分布较为均一。纳米粒的zeta电位为+35 mV，证实其在悬浮液中具有较高的静电稳定性。载药效率达到86.80%，载药量为14.14%，表明该纳米递送系统能有效包封和保护香芹酚，为其在胃肠道中的稳定性和控释特性提供了保障。
促进生长与改善饲料效率
动物实验结果表明，日粮中添加CRV-CHNPs能线性提高育肥兔的平均日增重（ADG），同时线性降低日采食量（DFI），从而显著改善饲料转化率（FCR）和性能指数（PI）。这种促生长效应在400 mg/kg和800 mg/kg剂量组之间无显著差异，表明400 mg/kg已达到效应平台期。生长性能的改善可能与CRV-CHNPs后续被证实的促进消化酶活性、优化肠道菌群以及增强营养物质吸收利用等多重作用密切相关。
优化胴体性状与肉品质
在胴体性状方面，CRV-CHNPs的添加线性提高了屠宰率、 dressing percentage 以及肝脏和肾脏的相对重量，同时线性降低了腹部脂肪沉积。对胃肠道环境的影响表现为，盲肠和十二指肠的pH值均线性下降，这为有益菌群的生长创造了更有利的微环境。然而，日粮处理对心脏、肺、脾脏等器官的相对重量以及肉样的常规化学成分（粗蛋白、脂肪、灰分）未产生显著影响，说明CRV-CHNPs主要作用于代谢和机体健康指标，而非基本肉质成分。
增强肝肾功能与改善脂质谱
生化指标显示，CRV-CHNPs能线性提高血清总蛋白、白蛋白和球蛋白水平，表明动物整体营养和免疫状况得到改善。更为重要的是，其对肝功能标志物丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）的活性，以及肾功能标志物尿素和肌酐的水平，均产生了二次方降低效应，最优剂量预测在450-500 mg/kg之间。组织学检查证实，补充CRV-CHNPs能有效减轻肝脏的炎性细胞浸润、胞浆空泡化和窦隙扩张，以及肾脏的间质炎症和管内透明管型，保护了肝肾的组织结构。在脂质代谢方面，CRV-CHNPs线性提高了高密度脂蛋白（HDL），同时降低了甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL），但对血糖水平无显著影响，显示出其改善血脂谱、促进代谢健康的积极作用。
强化机体抗氧化防御系统
CRV-CHNPs展现出强大的抗氧化潜力。补充CRV-CHNPs后，血清总抗氧化能力（TAC）以及关键抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性均呈二次方增加，而氧化应激标志物丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）的水平则二次方降低。还原型谷胱甘肽（GSH）浓度线性上升。多项式回归分析预测，针对不同抗氧化指标的最优剂量在400-500 mg/kg之间。这些结果综合表明，CRV-CHNPs能够有效增强机体的内源性抗氧化防御网络，减轻氧化损伤。
激活免疫系统应答
CRV-CHNPs对免疫系统产生了显著的调节作用。免疫球蛋白G（IgG）水平和溶菌酶活性随补充剂量线性增加。而免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）和补体3（C3）的水平则呈现二次方提升，最优剂量分别在400 mg/kg和450 mg/kg附近。这种对体液免疫和先天免疫成分的多方面增强，表明CRV-CHNPs能够全面调动机体的免疫防御能力，有助于抵抗病原侵袭。
提升消化道酶活性
研究发现，CRV-CHNPs的补充能显著影响消化酶的活性。淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性均以剂量依赖的方式被调节，且400 mg/kg与800 mg/kg剂量组间无显著差异。二次回归模型预测，对淀粉酶和脂肪酶的最优促进剂量约为500 mg/kg，对蛋白酶约为450 mg/kg。消化酶活性的提高直接促进了营养物质的分解与吸收，这可能是CRV-CHNPs改善饲料转化率和动物生长性能的重要机制之一。
重塑盲肠微生物群落结构
日粮中添加CRV-CHNPs对育肥兔盲肠微生物群落产生了深远影响。补充CRV-CHNPs后，有害细菌包括大肠杆菌、沙门氏菌和大肠菌群的数量均线性下降。相反，有益菌乳酸杆菌的数量则线性增加。400 mg/kg和800 mg/kg剂量组对有害菌和有益菌的影响均无显著差异。CRV的抗菌机制主要涉及破坏细菌细胞膜完整性，耗尽ATP，瓦解质子动力，并与膜磷脂形成复合物，最终导致细菌死亡。同时，盲肠pH值的降低也为乳酸菌等有益菌的生长创造了更适宜的环境。这种对肠道微生态的良性调控，对于维护肠道健康、抑制病原菌、提高整体健康水平至关重要。
多变量分析与最优剂量确认
通过热图聚类和主成分分析（PCA）等多变量统计分析手段，研究进一步证实了CRV-CHNPs处理组与对照组在多项生理指标上存在明显分离。热图显示，400 mg/kg剂量在提升有益参数（如抗氧化指标、免疫指标）和降低有害参数（如LDL、MDA）方面效果最为显著和一致。PCA结果也表明，不同剂量处理组形成了明显的聚类，其中400 mg/kg剂量组产生了最为独特的生理反应模式。综合多项式回归模型和多变量分析结果，研究最终确定日粮中添加400-500 mg/kg的CRV-CHNPs可为育肥兔的生长、健康和生产性能带来最全面的益处。
