《Journal of Applied Animal Research》：Evaluating the fermentation characteristics, bacterial community and predicted functional profiles of whole hulless barley silage with different additives in Tibet
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本文系统评估了酶制剂与乳酸菌（LAB）添加剂对西藏高原全株青稞青贮发酵品质、细菌群落结构及其预测功能谱的影响。研究发现，复合乳酸菌（L. plantarum 与 L. buchneri）处理（T3）能显著（p < 0.05）降低pH、提高乳酸（LA）含量，并优化微生物群落，提升辅因子与维生素代谢。研究为高海拔地区优质青贮饲料生产提供了理论依据和技术支撑。
Abstract
本研究旨在评估酶和乳酸菌（LAB）对全株青稞发酵特性、细菌群落及预测功能谱的影响。青稞分别接种蒸馏水（CON）、植物乳杆菌（T1）、植物乳杆菌+纤维素酶（CE）（T2）、植物乳杆菌+布氏乳杆菌（T3）进行处理。发酵60天后，T3处理的pH值最低（p < 0.05），乳酸（LA）含量最高（p < 0.05）。与T1处理相比，CON和T3处理中丙酸（PA）含量显著更高（p < 0.05）。在门水平上，厚壁菌门是所有处理中的优势菌门。在属水平上，乳酸植物杆菌属是所有处理中的优势菌属。T1和T3处理中慢生乳酸菌属的相对丰度较高，而泛菌属较低。功能预测分析表明，T3处理具有较低的碳水化合物代谢和较高的辅因子及维生素代谢。总之，接种乳酸菌和纤维素酶可通过调节细菌群落来提高青稞青贮品质，且复合乳酸菌添加剂效果更佳。
Introduction
西藏位于中国西南部，平均海拔约4000米。寒冷干燥的大陆性气候，加上贫瘠的土壤和短暂的生长季节，常常导致西藏大部分地区饲料短缺，这构成了该地区畜牧业生产的主要限制因素。在此背景下，扩大饲草资源已成为牧民和研究人员的紧要任务。青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum）是一年生禾本科作物，具有抗寒、抗旱、适应性强等特点，在高地地区广泛种植，被认为是畜牧业的替代饲料作物。青贮作为一种传统、重要且可靠的保存饲草和牧草的方法，旨在确保持续供应畜牧业，已在全球范围内，特别是在发达国家，受到越来越多的关注。青贮是一个多方面的生化过程，受温度、湿度、原料营养成分、收获时间、原料切碎长度、装填密度、原料微生物区系等多种因素影响。根据青贮原料的特性，在青贮生产过程中选择合适的添加剂对于促进乳酸菌发酵、最大限度地减少发酵底物损失以及优化青贮营养价值的保存至关重要。
酶制剂和乳酸菌接种剂是青贮生产中常用的添加剂。添加乳酸菌制剂可以增加青贮初期乳酸菌的数量，促进乳酸发酵，从而快速降低pH值，抑制有害微生物，减少发酵过程中的营养损失。纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶等酶制剂与乳酸菌结合用于青贮，可以通过消化植物茎秆、谷物和谷物细胞壁中的纤维素和半纤维素，释放细胞内的单糖、淀粉及其他营养物质，供乳酸菌进一步繁殖和发酵，从而提高饲料的干物质和中性洗涤纤维的消化率，改善青贮发酵过程，并提升其营养价值。
先前的研究表明，乳酸菌与酶结合使用的效果受发酵底物的限制。目前西藏青贮的研究主要集中在麦秸、玉米青贮或豆科牧草作为发酵底物，关于酶菌协同作用下全株青稞作为发酵底物的研究报道较少。因此，本研究旨在评估酶和乳酸菌对青稞青贮发酵特性、细菌群落及其预测功能潜力和表型的影响。
Materials and methods
Silage preparation and sampling
青稞种植于西藏自治区农牧科学院试验田（北纬29°38′34′′，东经91°2′31′′；年降水量426.5毫米，年均气温8.0°C）。新鲜青稞在蜡熟初期收获。植物乳杆菌和布氏乳杆菌添加剂购自镇江天益生物技术有限公司。青稞分别接种蒸馏水（CON）、植物乳杆菌（T1）、植物乳杆菌+纤维素酶（T2）、植物乳杆菌+布氏乳杆菌（T3）进行处理。乳酸菌和纤维素酶溶解于等体积蒸馏水中，喷洒到新鲜物料上（植物乳杆菌活性1×1010CFU/g，布氏乳杆菌活性1×1010CFU/g；植物乳杆菌添加量：0.1克/公斤鲜重；纤维素酶活性5×104U/g，添加量：0.01克/公斤鲜重；复合菌剂添加量：0.05克/公斤 + 0.05克/公斤鲜重）。全株青稞在实验室用切草机切成长2.5-3厘米的段。经不同添加剂处理或不处理的青稞转入真空密封聚乙烯塑料袋（28厘米×38厘米）中真空密封。每组设6个重复，每袋约800克饲料。样品在环境温度（23-27°C）下贮存发酵60天。
Fermentation characteristics and chemical composition analyzes
分析前，将新鲜青稞和青贮样品在乙醇消毒的容器中匀浆。约400克青稞或青稞青贮样品在65°C烘箱中烘干72小时以测定干物质（DM）含量。随后，将干燥样品通过1毫米筛网粉碎，用于进一步的化学成分分析。水溶性碳水化合物（WSC）含量采用蒽酮-硫酸法测定。粗蛋白（CP）含量采用凯氏定氮法测定。乙醚提取物（EE）含量测定参照AOAC方法。使用ANKOM纤维分析仪测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量。取10克青贮样品与90毫升蒸馏水匀浆获得提取液，4°C冰箱保存24小时。随后，提取液经四层纱布过滤用于分析发酵特性。滤液pH值立即用pH计测定。氨态氮（NH3-N）浓度采用苯酚-次氯酸盐法测定。滤液中的有机酸含量使用高效液相色谱法（HPLC）进行分析。简要步骤如下：青贮匀浆获得的滤液在4°C、10000×g离心15分钟去除颗粒物，上清液经0.22微米尼龙膜过滤以确保澄清。色谱分离在配备Carbomix H-NP5柱和示差折光检测器的Agilent 1260 HPLC系统上进行。洗脱液为2.5 mmol/L H2SO4，流速0.5毫升/分钟，柱温55°C。
使用OMEGA Soil DNA Kit提取总基因组DNA样品。样品在-20°C保存以待进一步分析。使用NanoDrop NC2000分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量和浓度。使用正向引物799F和反向引物1193R对细菌16S rRNA基因的V5-V7区域进行PCR扩增。PCR扩增产物使用Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads纯化。使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit进行定量。各自定量后，等量混合扩增子，在上海个人生物科技有限公司使用Illumina NovaSeq平台和NovaSeq 6000 SP Reagent Kit（500 cycles）进行双末端2×250 bp测序。
序列数据分析主要使用QIIME2和R包（v3.2.0）进行。使用QIIME2中的ASV表在ASV水平计算Alpha多样性指数，如Chao1丰富度估计量、观测物种数、Shannon多样性指数、Simpson指数、Faith's PD、Pielou均匀度和Good's覆盖率。与Silva 138数据库比对后，在门和属水平上确定青贮样品的细菌组成。使用R程序（version 4.2.0）图形化进行主坐标分析（PCoA）、冗余分析（RDA）和相似性分析（ANOSIM）。使用PICRUSt2（v. 2.2.0）从京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库预测细菌群落功能特征，即从样本中标记基因序列的比例预测细菌群落功能。使用R程序（version 4.2.0）对通路水平3的丰度进行热图分析。使用Graphpad Prism（version 9）绘制细菌群落中通路水平1和2及相关酶的丰度图。原始测序数据已存入NCBI的Sequence Read Archive（SRA），登录号为PRJNA11081498。
Statistical analysis
化学成分（DM、CP、WSC、ADF、NDF含量）和发酵特性（pH、LA、AA、PA、BA、NH3-N参数）以三个重复的平均值±标准误表示。使用SAS 9.0评估添加剂对青贮品质的影响。使用一般线性模型（GLM）分析所有测量数据，模型为：Yij = μ + αi + εij，其中μ为总体均值，αi为添加剂效应，εij为残差。
Results
Chemical compositions of whole Hulless Barley
青贮前原料的化学成分总结于表1。原料干物质（DM）含量为33.67%。青稞的水溶性碳水化合物（WSC）、粗蛋白（CP）、乙醚提取物（EE）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量分别占干物质的12.45%、5.57%、6.18%、47.80%和22.79%。
Ensiling performance of whole hulless barley with different additives
表2展示了不同处理下青稞青贮的发酵特性和营养指标。T3处理的pH值显著低于（p < 0.05）CON、T1和T2处理。CON、T1和T2处理间无显著差异。各实验处理间的NH3-N含量无显著差异。T3处理的LA含量最高（p < 0.05），其次是T2、T1和CON处理。同样，与CON处理相比，T1、T2和T3处理的LA/AA比值显著更高（p < 0.05）。此外，与T1处理相比，CON和T3处理的PA含量显著更高（p < 0.05）。各处理间的AA和BA浓度无显著差异。各处理间的DM含量无显著差异。值得注意的是，与CON处理相比，T2处理的CP含量显著更高（p < 0.05），NDF含量显著更低（p < 0.05）。
Bacterial diversity of whole hulless barley with different additives
青稞青贮细菌群落多样性总结于表3。通过16S rRNA扩增子测序，每个样品平均获得111,385条序列，所有样品的覆盖度约为0.99。添加剂的添加影响了细菌多样性的Chao1、Observed_species、Shannon和Simpson指数。CON处理的Chao1、Observed_species和Shannon指数高于T1和T2处理。与T1和T2处理相比，T3处理的Shannon和Simpson指数相对较高。构建了Venn图以说明所有原料和青贮样品间OTUs的相似性和重叠程度（图1）。如图所示，CON、T1、T2和T3处理共有168个OTUs，而各处理独有的OTUs分别为772、161、775和581个。
青稞青贮在门水平上的细菌群落组成如图2A所示。优势微生物为厚壁菌门（>75%）和变形菌门（>4%）。厚壁菌门丰度在T1处理中最高（95.7%），其次是T3（94.8%）、T2（82.6%）和CON（77.4%）处理。处理对变形菌门丰度有显著影响，其在CON处理中最高（22.1%），其次是T2、T3和T1处理（分别为16.7%、4.97%和4.18%）。门水平上所有其他微生物的丰度均低于0.1%。青稞青贮在属水平上的细菌群落组成如图2B所述。不同处理的青贮中发现了不同的微生物丰度。乳酸植物杆菌属是所有处理中的优势属，分别占微生物群的67.1%（CON）、89.9%（T1）、80.0%（T2）和63.6%（T3）。使用LEfSe分析确定不同处理青稞青贮中细菌类群的差异（图3）。与CON、T1和T2处理相比，T3处理中慢生乳酸菌属的相对丰度显著富集。此外，与T1和T3处理相比，CON和T2处理中泛菌属显著富集。
Predicted functions and pathways of bacterial community in whole hulless barley silage
基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路，使用PICRUSt2确定细菌代谢功能。如图4所示，代谢通路占比超过80%，显著高于其他通路，其次是遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程。图5显示了差异显著的前20个代谢功能。碳水化合物代谢、脂质代谢、辅因子和维生素代谢以及氨基酸代谢的丰度远高于其他通路。碳水化合物代谢在T1和T2处理中显著富集（p < 0.05），与CON处理相比，所有青贮样品的脂质代谢比例均显著增加（p < 0.05）。此外，与CON处理相比，接种LAB的青贮中氨基酸代谢更高（p < 0.05），能量代谢更低（p < 0.05）。与其他处理相比，T3处理的辅因子和维生素代谢比例更高（p < 0.05）。通路水平3的前50条代谢通路如图6所示。关键通路是碳水化合物代谢和氨基酸代谢。与CON相比，接种LAB的处理在磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢和糖酵解/糖异生方面表现出显著富集（p < 0.05）。
Discussion
青贮是一种广泛采用的牧草保存方法，可在新鲜牧草短缺时期为反刍动物提供适口性好的饲料来源。本研究结合理化分析和16S rRNA基因测序，评估了经植物乳杆菌、布氏乳杆菌和酶处理的青稞的青贮性能和微生物群落，这有助于理解LAB对牧草青贮的影响。
原料的DM含量、WSC含量和LAB种群是影响青贮性能的主要因素。发酵物料中的DM含量是直接影响青贮品质的关键组成部分。蜡熟期收获的青稞DM含量为33%，符合禾本科牧草理想干物质值（通常在30%至40%之间），可用于生产优质青贮。优质青贮的WSC要求高于5% DM，本研究中的WSC含量（12.45%）满足此要求。
pH是青贮品质的关键指标，优质发酵的最佳pH值范围为3.8至4.2。然而，在本研究中，除T3处理外，所有处理的pH均高于4.20，这与先前一项因原料DM含量较高导致青贮pH较高的研究结果一致。接种LAB的青贮与CON处理相比pH降低，T3处理的pH最低。这可能是因为LAB添加剂通过同型发酵LAB中的Embden–Meyerhof途径、磷酸酮醇酶途径和磷酸戊糖途径增加了LA和AA的产量。此外，T3处理结合两种LAB物种产生了更酸性的环境，协同促进了LAB生长，从而导致更低的pH和更高的LA水平。LA与AA的比值常被用作青贮发酵的指标之一。本研究中所有处理的LA/AA比值均超过2.0，表明观察到的青稞发酵模式为同型乳酸发酵类型。PA、BA和NH3-N的浓度是影响青贮发酵的主要不利因素。试验中PA的最大浓度低于0.11% DM，低于1% DM，被认为是可接受的。同时，整个青贮过程中检测到的BA很少，表明青贮中梭菌发酵极少。青贮的最终NH3-N浓度低于总氮（TN）的7.69%，未超过保存良好青贮的10% TN上限。这表明青贮中没有发生显著的蛋白水解。青贮中PA、BA和NH3-N处于可接受水平，是由于青贮初期快速酸化，有效抑制了相关细菌和酶活性。
使用16S rRNA测序评估青稞青贮中的细菌多样性和组成。本研究中，所有样品的覆盖度均大于0.99，表明测序能够准确反映细菌群落。细菌丰富度和物种多样性通过Chao1和Shannon指数反映。在当前研究中，接种LAB的处理与CON处理相比表现出更低的Chao1和Shannon指数，这与研究发现因有害微生物被抑制并逐渐被LAB取代而导致Alpha多样性降低的结果一致。本研究中，优势门是厚壁菌门，这与先前研究发现厚壁菌门是青贮中的优势门的结果一致。一个主要解释可能是厚壁菌门微生物能在低pH和厌氧条件下茁壮成长。青贮60天后，接种或不接种LAB的青稞细菌群落结构各异。CON处理中乳酸植物杆菌属主导发酵，其次是泛菌属、埃希氏菌属、慢生乳酸菌属和乳酸球菌属；而在接种LAB的青稞中，慢生乳酸菌属的丰度增加，泛菌属和乳酸球菌属减少。这些结果可解释为LAB的添加创造了一个有利于LAB生长的环境。
确定参与青贮生产的细菌的预测功能谱和代谢通路具有重要意义。使用PICRUST2的KEGG数据库评估了从水平1到水平3的预测细菌群落功能谱。图4说明代谢是主要代谢通路。基于丰度，碳水化合物、脂质、氨基酸、核苷酸、辅因子、维生素和能量代谢主导了参与青贮发酵的微生物群的水平2功能谱（图5）。在青贮过程中，牧草中的碳水化合物在厌氧条件下被LAB发酵，产生短链脂肪酸（SCFAs），主要是乳酸。这一过程可能解释了青贮期间碳水化合物代谢丰度较高的原因。通常，牧草中的维生素在青贮过程中会降解。本研究发现T3处理增强了辅因子和维生素的代谢，这表明青贮品质得到改善，因为日粮中的维生素（如α-生育酚和β-胡萝卜素）有益于反刍动物的免疫系统，这与特定LAB支持的增强的辅因子和维生素代谢有益于青贮期间维生素生产的发现一致。据报道，LAB的能量代谢对于促进青贮中LA的产生至关重要。有研究指出优质青贮应促进能量代谢。然而，本试验的结果不一致，即使发酵良好，LAB接种并未促进青稞的能量代谢，这与Zhao等人的结果一致。此外，在LAB处理组中观察到核苷酸代谢以及复制和修复的丰度较高。根据Kilstrup等人的研究，核苷酸可用于合成和复制RNA和DNA，并作为细胞过程的主要能源。这表明LAB处理青贮中的LAB菌株在青贮阶段快速增殖，这与所有处理组中LAB（包括乳酸植物杆菌属、慢生乳酸菌属和轻链乳酸菌属）的最高丰度一致。水平3的前50条代谢通路如图6所示。LAB处理促进了大多数碳水化合物成分（氨基糖、核苷酸糖、蔗糖等）的代谢，这证实了LAB可以利用多种碳水化合物来源进行增殖。糖异生和糖酵解代谢、TCA循环和磷酸戊糖途径是主要的碳水化合物代谢途径。已知Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径是最常见的糖酵解类型，协助同型发酵LAB将葡萄糖发酵成LA。因此，我们推测青贮后糖酵解丰度较高可能与丰富的同型发酵LAB有关，这与我们的细菌群落发现一致。同时，T3处理中异型发酵LAB丰度较高可能解释了磷酸戊糖（PPP）途径丰度较高的原因。
Conclusion
总之，作为西藏重要的补充饲草，青贮发酵可以改善青稞的适口性和营养价值。添加乳酸菌和纤维素酶可通过调节细菌群落来提高青稞青贮品质，且复合乳酸菌添加剂的效果优于单一乳酸菌或乳酸菌与纤维素酶混合添加剂。这些发现可能为优化高海拔地区青稞青贮生产提供一个框架。
Author contributions
H.S.和H.D.负责研究构思与设计；H.S.负责起草稿件；X.X.和F.H.负责数据采集；Z.Z.负责数据分析和/或解释；H.S.、X.X.和C.J.负责审阅/修订；H.T.和Z.Y.负责资金支持与监督。所有作者均已阅读并同意稿件的最终版本。
Data availability statement
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获取。
