《Biomolecules》：Characterization of a Thermophilic and Acidophilic GH78 α-L-Rhamnosidase from Thermotoga sp. 2812B Capable of Efficiently Hydrolyzing a Variety of Natural Flavonoid Diglycosides
编辑推荐：
本文鉴定并表征了来自Thermotoga sp. 2812B的新型GH78 α-L-鼠李糖苷酶TsRha。该酶具有（α/α）6-桶状催化结构域，最适反应条件为90°C和pH 5.0，表现出卓越的热稳定性和有机溶剂耐受性。研究显示TsRha能高效水解多种糖苷键（α-1,2/α-1,6/α-1）的黄酮二糖苷，20-100分钟内转化率≥99.1%，为功能性食品和医药行业提供了高性能生物催化剂。
生物信息学与结构分析揭示TsRha新特性
通过基因组挖掘，研究人员从Thermotoga sp. 2812B中鉴定出一种新型GH78 α-L-鼠李糖苷酶TsRha。系统发育分析显示，TsRha属于以谷氨酸（Glu）作为催化通用酸的亚家族II，与热纤网菌（Dictyoglomus thermophilum）的DtRha和嗜热petrophila菌（Thermotoga petrophila）的TpeRha具有高度同源性。序列比对发现，TsRha的Glu469和Glu746分别作为催化通用酸和通用碱，其保守基序（DCPQRDERMGWLGD和GATTLWERW）在细菌Rha78s中高度保守。
结构预测显示，TsRha包含五个结构域：一个α-螺旋催化结构域A（残基439-775）和四个β-折叠结构域（N、E、F、C）。催化结构域呈现典型的（α/α）6-桶状折叠，与已报道的Rha78s结构一致。Glu469与Glu746之间的距离为6.1-6.4?，符合糖苷水解酶的倒置催化机制特征。
高效表达与酶学性质表征
TsRha在大肠杆菌BL21(DE3)中成功实现异源表达，经镍柱纯化获得高纯度蛋白。酶学性质研究表明：
- •
最适pH为5.0，在pH 4.0-6.5范围内保持>85.7%活性，显示强嗜酸性
- •
最适温度达90°C，在75-95°C仍保持59.6%-76.6%活性，体现显著嗜热性
- •
80°C处理3小时后保留82.6%活性，90°C处理3小时仍存60.5%活性，热稳定性突出
- •
在10%（v/v）有机溶剂（甲醇、DMSO等）中保持44.1%-63.0%活性，具备有机溶剂耐受性
底物选择性展现广泛催化潜力
以对硝基苯苷（pNP-glycosides）为底物时，TsRha对pNPαRha显示最高活性（31.7 U/mg），对pNPβGlc和pNPβGal有微弱活性，表明其兼具弱β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性。
对天然黄酮苷的催化实验显示，TsRha可高效水解多种糖苷键：
- •
α-1,2糖苷键：柚皮苷（2.4 U/mg）、新橙皮苷（2.6 U/mg）等黄烷酮二糖苷
- •
α-1,6糖苷键：芦丁（3.3 U/mg）、橙皮苷（1.9 U/mg）等黄酮醇二糖苷
- •
α-1糖苷键：淫羊藿苷（0.4 U/mg）等异戊烯化黄酮苷
分子对接结果表明，底物通过氢键和π-π堆积作用与TsRha的底物结合口袋稳定结合，其宽泛的底物谱覆盖黄烷酮、黄酮、黄酮醇和二氢查尔酮等多个黄酮亚类。
高效生物转化实现稀有黄酮苷制备
TsRha在生物转化中表现出卓越效率：
- •
柚皮苷→普鲁宁：20分钟转化率99.9%
- •
柚皮苷二氢查尔酮→三叶豆苷：40分钟转化率99.9%
- •
芦丁→异槲皮苷：15分钟转化率99.3%
- •
橙皮苷→橙皮素-7-O-葡萄糖苷：60分钟转化率99.1%
- •
曲克芦丁→曲克异槲皮素：100分钟转化率99.2%
- •
淫羊藿苷→淫羊藿次苷I：120分钟转化率80.0%
讨论与展望：新型生物催化剂的工业应用潜力
与多数中温细菌Rha78s（最适温度40-70°C）相比，TsRha的嗜热特性（90°C）可显著提高底物溶解度和反应效率。其酸性最适pH（5.0）区别于大多数细菌Rha78s的中性偏好，更接近真菌来源酶的特性。值得注意的是，TsRha对α-1糖苷键的水解能力在已报道的α-L-鼠李糖苷酶中较为罕见，为淫羊藿苷等药用黄酮的转化提供了新工具。
结构适应性分析表明，TsRha可能通过独特的结构修饰实现在高温下的稳定性和功能性。虽然其有机溶剂耐受性略低于TpeRha等极端嗜热酶，但在10%（v/v）有机溶剂中的活性保持能力足以满足双相反应体系的需求。
结论：多功能生物催化剂的成功开发
本研究成功鉴定并表征了具有（α/α）6-桶状结构域的GH78 α-L-鼠李糖苷酶TsRha。该酶集高活性、嗜热性、嗜酸性、优良热稳定性和宽底物谱于一体，能高效转化多种天然黄酮二糖苷为高价值黄酮葡萄糖苷。这些特性使TsRha成为功能性食品、医药和健康产品领域极具潜力的生物催化剂，为稀有黄酮苷的绿色制备提供了新策略。
