《Biomolecules》：Phosvitin-Derived Peptide Pt5-1c Is a Pro-Angiogenic Agent Capable of Enhancing Wound Healing
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本文推荐一篇关于抗菌肽（AMP）Pt5-1c促进血管再生的研究。该研究证实，源自鱼类卵黄高磷蛋白的Pt5-1c能通过激活PI3K/AKT/mTOR和p38 MAPK通路及HIF-1-VEGF轴，上调VEGF、PDGF等促血管生成因子，增强内皮细胞运动、粘附、存活及成管能力，并在小鼠伤口模型和斑马鱼血管缺陷模型中显著促进血管新生，为慢性伤口治疗提供了新型候选药物。
摘要
抗菌肽（AMPs）已被证明具有促血管生成活性，能够增强新生血管形成并促进慢性伤口的愈合。本研究清晰地表明，源自鱼类卵黄高磷蛋白的抗菌肽Pt5-1c能够在小鼠全层伤口模型和血管缺陷斑马鱼模型中增强血管生成。Pt5-1c能够促进内皮细胞的运动、粘附、存活、丝状伪足突出，并诱导内皮细胞成管。此外，研究发现Pt5-1c可上调包括VEGF、PDGF、FGF和EGF在内的促血管生成因子的产生。研究揭示，Pt5-1c通过同时激活PI3K/AKT/mTOR和p38 MAPK通路以及HIF-1-VEGF轴来促进内皮细胞的运动、生长和存活。显然，Pt5-1c是血管再生疗法中一种新型的促血管生成剂候选物。
1. 引言
皮肤是人体天然的保护层，慢性伤口的一个标志是由于微循环障碍和内皮功能障碍导致的异常血管生成。血管生成，即从预先存在的毛细血管或毛细血管后小静脉形成新血管，对于有效的伤口修复至关重要。抗菌肽（AMPs）是天然免疫反应的一部分，除了抗菌活性外，许多AMPs还表现出组织修复特性。先前的研究已证明，源自鱼类卵黄高磷蛋白的29个氨基酸肽Pt5-1c具有抗菌特性和伤口愈合能力，但其是否具有促血管生成特性尚不清楚。本研究旨在利用小鼠、转基因斑马鱼和内皮细胞系模型在体内和体外回答这个问题。
2. 材料与方法
2.1. 抗菌肽Pt5-1c
鱼类卵黄高磷蛋白衍生的AMP Pt5-1c由上海生工生物工程股份有限公司采用标准固相9-芴甲氧羰基（FMOC）法合成。其氨基酸序列为SRMKKWAKIIEKWRKWHKKRWLAHHSATK，观测分子量为3755 Da。
2.2. 细胞培养
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中培养。
2.3. 划痕愈合实验
Pt5-1c能以时间和剂量依赖的方式增加划痕愈合。在抑制剂研究中，HUVECs在划痕前用渥曼青霉素（PI3K抑制剂）或SB203580（p38 MAPK抑制剂）预孵育。
2.4. Transwell实验
Pt5-1c在0.25 μg/mL至2 μg/mL浓度范围内显示出显著的跨膜侵袭能力。
2.5. F-肌动蛋白染色
用TRITC标记的鬼笔环肽对F-肌动蛋白纤维进行染色，评估丝状伪足形成。
2.6. 细胞粘附实验
Pt5-1c能以时间和剂量依赖的方式显著增加HUVECs对纤连蛋白的粘附。
2.7. 细胞增殖实验
通过EdU掺入法、细胞生长测定和CCK-8法评估细胞增殖。Pt5-1c能逆转丝裂霉素C对细胞增殖的抑制作用，并显著提高EdU阳性HUVECs的比例、总细胞数和细胞活力。
2.8. 体外成管实验
在基质胶上评估HUVECs的成管能力。Pt5-1c导致总毛细血管长度和节点数显著增加。
2.9. 斑马鱼血管系统可视化
利用转基因斑马鱼品系Tg(flk: mCherry)建立血管缺陷模型。Pt5-1c能逆转PTK787诱导的斑马鱼血管缺陷，并以剂量依赖的方式恢复节间血管（ISVs）的生成和长度。
2.10. 小鼠背部皮肤伤口模型的建立
在小鼠背部制造全层伤口，用Pt5-1c（10 μg/mL）或无菌盐水（对照组）处理。
2.11. 免疫荧光和免疫组织化学分析
使用CD31、α-SMA和VEGFA抗体通过免疫组织化学染色检测伤口部位的血管生成。
2.12. Pt5-1c毒性评估
通过H&E染色评估Pt5-1c对主要器官的组织病理学影响。
2.13. Western Blot实验
检测HUVECs和伤口皮肤组织中VEGFA、AKT、p-AKT、p-mTOR、p38、p-p38等蛋白的表达水平。
2.14. 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
检测HUVECs、HaCaT细胞、HELF细胞和小鼠伤口组织中促血管生成生长因子基因的表达。
2.15. 分子对接
使用HDOCK服务器预测Pt5-1c与PI3K、AKT、mTOR、p38靶蛋白的优先结合位点。
2.16. 统计分析
实验数据以均值±标准差表示，使用Student's t检验或单因素ANOVA进行统计分析。
3. 结果
3.1. Pt5-1c促进内皮细胞的运动、粘附、存活和丝状伪足突出
划痕和Transwell实验表明，Pt5-1c能以时间和剂量依赖的方式促进HUVECs的迁移。F-肌动蛋白染色显示Pt5-1c处理显著增加了丝状伪足密度。细胞粘附实验证实Pt5-1c增强了HUVECs对纤连蛋白的粘附。EdU掺入、细胞计数和CCK-8实验均证明Pt5-1c能促进内皮细胞的增殖和存活。
3.2. Pt5-1c促进成管和促血管生成因子的产生
体外成管实验显示，Pt5-1c处理显著增加了总毛细血管长度和节点数。qRT-PCR分析表明，Pt5-1c（1 μg/mL）上调了HUVECs和HELF细胞中VEGFA、PDGFA、FGF2、EGF和HIF-1α的基因表达；在HaCaT细胞中，VEGFA、EGF和HIF-1α的表达也增加。在小鼠伤口模型中，Pt5-1c处理显著增强了Vegfa、Pdgfc和Fgf2的基因表达以及VEGFA蛋白的合成。
3.3. Pt5-1c促进血管缺陷斑马鱼的血管生成
在PTK787诱导的血管缺陷斑马鱼模型中，Pt5-1c处理能以剂量依赖的方式逆转ISVs生长的抑制，恢复血管生成。
3.4. Pt5-1c增强伤口部位的血管生成
Pt5-1c处理的小鼠伤口部位在损伤后第6天和第9天显示出更密集的微血管网络，CD31和α-SMA免疫荧光染色证实了成熟新生血管的存在。H&E染色显示Pt5-1c处理的大鼠主要器官未见组织损伤，表明其良好的生物安全性。
3.5. Pt5-1c通过激活PI3K/AKT/mTOR和p38 MAPK通路增强血管生成
Western Blot分析显示，Pt5-1c处理导致HUVECs中AKT、mTOR和p38的磷酸化水平显著增加。预孵育渥曼青霉素或SB203580可明显削弱Pt5-1c促进内皮细胞迁移和成管的能力。分子对接分析表明，Pt5-1c与PI3K、AKT、mTOR和p38具有良好的结合亲和力。
4. 讨论
本研究清楚地表明，卵黄高磷蛋白衍生的29个氨基酸肽Pt5-1c具有强大的促血管生成作用。其证据包括增强伤口部位的成熟血管生成、恢复血管缺陷斑马鱼ISVs的形成和生长，以及促进内皮细胞功能。Pt5-1c还能上调多种促血管生成生长因子。其促血管生成特性与我们早期的发现——Pt5-1c能促进上皮再生和肉芽组织形成——相辅相成。Pt5-1c的C末端酰胺化和位点特异性取代使其形成紧凑的α螺旋构象，从而赋予其抗蛋白酶降解的稳定性，且体内外实验均显示其具有良好的生物安全性。
在机制上，Pt5-1c通过激活PI3K/AKT/mTOR和p38 MAPK信号通路以及HIF-1-VEGF轴来发挥其促血管生成作用。分子对接揭示了Pt5-1c与这些激酶之间的潜在结合相互作用。我们提出，Pt5-1c同时或顺序激活PI3K/AKT/mTOR和p38 MAPK通路以及HIF-1-VEGF轴，进而协同刺激VEGF、PDGF、FGF和EGF等主要促血管生成因子的产生，最终触发细胞迁移、粘附、增殖和生长，增强血管生成。然而，Pt5-1c是否通过结合特定受体来启动这些信号，仍是未来研究的重要问题。
5. 结论
总之，本研究强调Pt5-1c是血管再生疗法中一种新型的促血管生成剂候选物。其同时促进内皮细胞多种功能和上调多种促血管生成生长因子的能力，虽然与其他AMPs的多效性类似，但却是通过独特且互补的机制实现的。未来的工作可能采用整合多组学和功能遗传学方法来精确描绘Pt5-1c的分子靶点和信号层级。
