《Cell Reports》：ASFV p54 manipulates the secretory carrier membrane protein 3-dependent apoptotic bodies pathway to enhance cell-cell transmission
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非洲猪瘟病毒(ASFV)是威胁全球养猪业的重大病原，尚无有效疫苗。本研究聚焦ASFV p54蛋白与宿主分泌载体膜蛋白3(SCAMP3)的相互作用机制，发现p54羧基末端150-184氨基酸 motif 是结合SCAMP3并诱导凋亡的关键区域。通过构建p54△CTM缺失突变株，研究人员证实破坏该相互作用可将细胞死亡方式从凋亡转变为铁死亡(ferroptosis)，显著降低病毒通过凋亡小体(ApoBDs)的传播能力，同时突变株对家猪致病性减弱并能提供免疫保护。该研究为ASFV减毒疫苗开发提供了新策略。
非洲猪瘟病毒(ASFV)自1921年在非洲首次发现以来，已成为全球养猪业的"头号杀手"，特别是2018年传入中国后造成巨大经济损失。这种病毒可引起家猪和野猪出现高烧、全身性出血等症状，死亡率高达100%。更令人担忧的是，近一个世纪过去，科学界仍未研发出有效的商业化疫苗。ASFV之所以如此"狡猾"，是因为它进化出了多种机制来劫持宿主的细胞过程，包括程序性细胞死亡途径，从而增强其传播和致病能力。
在《细胞·报告》(Cell Reports)最新发表的研究中，中国农业大学与中国农业科学院上海兽医研究所的联合团队揭开了ASFV操控宿主细胞的新机制。研究人员发现，ASFV编码的p54蛋白能够与宿主细胞的分泌载体膜蛋白3(SCAMP3)相互作用，巧妙利用凋亡小体(ApoBDs)作为"特洛伊木马"，实现病毒在细胞间的有效传播。当研究人员通过基因工程手段破坏这种相互作用时，病毒不仅失去了通过凋亡小体传播的能力，还意外地触发了一种名为铁死亡(ferroptosis)的新型细胞死亡途径，显著降低了病毒的致病性，同时激发了有效的免疫保护反应。这一发现不仅深化了对ASFV致病机制的理解，更为开发新型减毒活疫苗提供了创新思路。
研究人员运用了多种关键技术方法开展此项研究。他们通过免疫共沉淀结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术筛选p54相互作用蛋白；利用基因编辑技术构建p54羧基末端不同片段缺失的重组病毒株；采用活细胞实时成像技术观察病毒细胞间传播动态；通过蛋白质组学分析鉴定差异表达蛋白；建立了猪体感染模型评估病毒致病性和疫苗保护效果。实验使用的猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)来源于健康商品猪，骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)和外周血单核细胞(PBMCs)均从实验猪体制备。
相互作用between p54 and SCAMP3 promotes apoptosis
研究团队首先通过免疫共沉淀结合质谱分析技术，在ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中筛选到67个与p54存在相互作用的候选蛋白。经过生物功能筛选，研究人员将目光锁定在SCAMP3上——一个在膜泡运输和生物发生中起关键作用的蛋白。随后的免疫共沉淀和免疫荧光实验证实，p54确实能够与SCAMP3结合，并且这种相互作用发生在内质网区域。更有趣的是，双分子荧光互补(BiFC)实验在活细胞中直观展示了p54与SCAMP3在核周区域的动态相互作用。
当研究人员在WSL细胞和PAMs中同时过表达p54和SCAMP3时，发现两者共同表达可显著增强caspase-3介导的细胞凋亡。相反，当使用小干扰RNA(siRNA)敲低SCAMP3表达后，p54诱导的凋亡水平明显下降。这些结果明确表明，p54与SCAMP3的相互作用在调控细胞凋亡中扮演着关键角色。
Identification of key amino acid motifs in p54 critical for interaction with SCAMP3
为了精确定位p54与SCAMP3相互作用的关键区域，研究人员利用AlphaFold预测了蛋白质复合体的三维结构，发现p54羧基末端的150-184氨基酸区域可能是关键的相互作用位点。值得注意的是，该区域包含了此前报道的p54与动力蛋白轻链8(DLC8)结合的凋亡诱导基序(150-164氨基酸)。研究人员构建了两个截短突变体：p54△DBM(缺失150-164氨基酸)和p54△CTM(缺失150-184氨基酸)。免疫荧光和共定位分析显示，p54△CTM与SCAMP3的共定位程度显著低于野生型p54和p54△DBM。免疫共沉淀实验进一步证实，p54△CTM与SCAMP3的相互作用明显减弱。
The ability of ASFV-p54△CTM to utilize ApoBDs for cell-cell transmission is severely impaired
基于上述发现，研究人员基于高致病性ASFV中国分离株GZ201801(ASFV-GZ)，通过同源重组技术构建了两种重组病毒：ASFV-p54△DBM(缺失150-164氨基酸)和ASFV-p54△CTM(缺失150-184氨基酸)。病毒生长曲线显示，ASFV-p54△CTM在感染后期(72小时)的病毒滴度比野生型病毒低近5.5倍。
通过活细胞实时成像技术，研究人员观察到感染ASFV-EGFP和ASFV-p54△DBM的PAMs会产生大量EGFP阳性的凋亡小体，这些凋亡小体从细胞表面脱落并被周围巨噬细胞吞噬，开启新的感染周期。然而，感染ASFV-p54△CTM的细胞几乎不产生典型的凋亡小体，反而出现快速肿胀和破裂现象，EGFP荧光在约1分钟内迅速消失。定量分析表明，ASFV-p54△CTM感染组中凋亡小体的浓度显著低于其他两组。
病毒滴度测定结果显示，与ASFV-GZ组相比，ASFV-p54△CTM感染组在凋亡小体相关病毒和细胞外病毒部分的滴度显著降低，但细胞内病毒滴度反而更高。这表明ASFV-p54△CTM利用凋亡小体进行细胞间传播的能力严重受损。
SCAMP3 participates in the mediation of ApoBDs formation during apoptosis
研究人员进一步探究了SCAMP3在凋亡小体形成中的直接作用。实验发现，在STS(星形孢菌素)诱导的细胞凋亡中，过表达SCAMP3可显著增加凋亡小体的产量，且产量与SCAMP3表达水平呈正相关，但不会影响caspase-3的活化水平。相反，敲低SCAMP3则显著减少STS诱导的凋亡小体产生，同样不影响细胞凋亡本身。这些结果表明，SCAMP3特异性促进凋亡执行阶段凋亡小体的形成，而不影响凋亡的启动过程。
ASFV-p54△CTM triggers ferroptosis in PAMs
对ASFV-p54△CTM感染PAMs的蛋白质组学分析发现，与铁死亡相关的多个蛋白表达发生显著变化，特别是谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)表达下调。GCLC是合成谷胱甘肽(GSH)的关键酶，而GSH是抵抗铁死亡的重要分子。实验证实，ASFV-p54△CTM感染组的GSH含量确实显著降低。
进一步检测发现，ASFV-p54△CTM感染可导致细胞内丙二醛(MDA)水平显著升高，表明脂质过氧化程度加剧。同时，细胞内活性氧(ROS)和Fe2+水平也明显上升。当使用铁死亡抑制剂liproxstatin-1或ferrostatin-1处理细胞后，ASFV-p54△CTM诱导的MDA、ROS和Fe2+水平升高均被显著逆转，GSH水平得到恢复。这些结果共同表明，ASFV-p54△CTM感染可诱导细胞发生铁死亡。
ASFV-p54△CTM has lost pathogenicity for domestic pigs
动物实验结果显示，接种ASFV-GZ的猪在感染后3-4天出现高热和典型非洲猪瘟临床症状，所有猪在8天内死亡。接种ASFV-p54△DBM的猪在6天后出现发热，部分死亡，部分康复。而接种ASFV-p54△CTM的猪在整个56天观察期内保持健康，全部存活。
病毒DNA检测发现，ASFV-p54△CTM接种组仅出现低水平病毒血症(102.45-103.52copies/mL)，且在21天后检测不到病毒。口、鼻、直肠拭子中的病毒排放量也显著低于其他组。病理检查显示，ASFV-p54△CTM接种猪无显著 macroscopic器官损伤，组织中检测不到病毒DNA。
ASFV-p54△CTM induces higher immune responses than does ASFV-GZ in pigs
免疫应答分析发现，ASFV-p54△CTM接种猪在感染后第9天即可检测到针对p72、p30和p54的高水平抗体，而ASFV-GZ接种猪未检测到抗体反应。这表明ASFV-p54△CTM具有更强的免疫原性。
ASFV-p54△CTM can resist the challenge of the parental strain
保护性实验表明，接种ASFV-p54△CTM的猪在28天后用致死剂量的亲本ASFV-GZ攻击，仅出现短暂低热，随后恢复正常。而安慰剂组猪全部在攻击后7天内死亡。攻击后，免疫组猪病毒血症水平显著低于对照组，且p72抗体水平在攻击后第5天即开始上升并持续存在。
这项研究系统阐明了ASFV p54蛋白通过与其宿主靶标SCAMP3相互作用，调控细胞死亡方式并促进病毒传播的分子机制。研究发现，p54羧基末端150-184氨基酸 motif 是结合SCAMP3并诱导凋亡的关键区域。破坏这一相互作用不仅削弱了病毒通过凋亡小体的传播能力，还将细胞死亡方式从凋亡转变为铁死亡。这种转变一方面限制了病毒的细胞间传播，另一方面可能通过铁死亡特有的免疫原性激活宿主免疫应答，从而产生保护效果。
研究的创新性在于首次揭示了SCAMP3在病毒诱导的凋亡小体形成中的关键作用，并发现通过精准调控病毒蛋白与宿主因子的相互作用，可改变细胞死亡方式，进而影响病毒致病性。ASFV-p54△CTM减毒株的成功构建及其展现的良好安全性和免疫保护效果，为ASFV减毒活疫苗的研发提供了新思路。这一"一石二鸟"的策略——既削弱病毒传播能力又增强免疫原性，可能为其他病毒疫苗的设计提供借鉴。
当然，研究也存在一定局限性，如p54-SCAMP3相互作用调控细胞死亡转换的具体分子机制尚不完全明确，SCAMP3在凋亡小体形成中的精确功能需要进一步解析，以及ASFV-p54△CTM疫苗候选株在更广泛猪群中的保护效果需要更多验证。尽管如此，这项工作无疑为理解ASFV致病机制和开发有效防控措施提供了重要理论依据和实践方向。
